בידוד לא מימי והעשרה של גבעול קפיטט בלוטי וטריכומות ססילה מקנאביס סאטיבה
Summary
מוצג פרוטוקול לבידוד והעשרה נוחים ובעלי תפוקה גבוהה של גבעול קפיטט בלוטי וטריכומות ססיל מקנאביס סאטיבה. הפרוטוקול מבוסס על מיצוי יבש ללא חיץ של טריכומות באמצעות חנקן נוזלי בלבד, קרח יבש ומסננות ניילון ומתאים למיצוי RNA וניתוח שעתוק (transcriptomic analysis).
Abstract
מאמר זה מציג פרוטוקול לבידוד והעשרה נוחים ובעלי תפוקה גבוהה של גבעול קפיטט בלוטי וטריכומות ססיליות מקנאביס סאטיבה. המסלולים הביוסינתטיים למטבוליזם של קנבינואידים וטרפנים נדיפים ממוקמים בעיקר בטריכומות הקנאביס , וטריכומות מבודדות מועילות לניתוח תעתיק. הפרוטוקולים הקיימים לבידוד טריכומות בלוטות לאפיון שעתוק אינם נוחים ומספקים ראשי טריכומות פגומים וכמות נמוכה יחסית של טריכומות מבודדות. יתר על כן, הם מסתמכים על מכשירים יקרים ואמצעי בידוד המכילים מעכבי חלבון כדי למנוע פירוק RNA. הפרוטוקול הנוכחי מציע לשלב שלושה שינויים נפרדים כדי להשיג כמות גדולה של גבעול קפיטט בלוטי מבודד וטריכומות ססיליות מתפרחות נקביות בוגרות של C. sativa ועלי מניפה, בהתאמה. השינוי הראשון כרוך בהחלפת חנקן נוזלי באמצעי הבידוד הקונבנציונלי כדי להקל על מעבר הטריכומות דרך המיקרו-מסננות. השינוי השני כרוך בשימוש בקרח יבש כדי לנתק את הטריכומות ממקור הצמח. השינוי השלישי כרוך בהעברת החומר הצמחי ברציפות דרך חמש מיקרו-מסננות בגודל נקבוביות הולך ופוחת. הדמיה מיקרוסקופית הדגימה את יעילות טכניקת הבידוד עבור שני סוגי הטריכומות. בנוסף, איכות הרנ”א שהופק מהטריכומות המבודדות התאימה לניתוח שעתוק במורד הזרם.
Introduction
טריכומות בלוטות הן מבנים דמויי שיער הנמצאים בצמחים המכילים מטבוליטים שניוניים רבים1 ומייצגים בנק רב ערך של גנים ואנזימים ביוסינתטיים חדשים2. בקנאביס, הביוסינתזה של המטבוליטים המשניים החשובים, קנבינואידים3 וטרפנים4, ממוקמת בטריכומות. בהתחשב בתפקידם של הטריכומות בקביעת איכות הקנאביס הן לשימושים רפואיים והן לשימושים פנאי, המחקר של ביטוי גנים של טריכומות הוא מעניין. כדי לאפיין את הביטוי של גנים ספציפיים לטריכומות, יש לבודד תחילה את הטריכומות המעניינות. פרוטוקולי בידוד טריכומות תוארו לראשונה כבר בשנת 19925, וההתפתחויות האחרונות שלהם נסקרו לאחרונה2. באופן כללי, ניתן לחלק פרוטוקולים לחילוץ טריכומות בלוטות לאפיון שעתוק לשני שלבים עוקבים נפרדים. השלב הראשון כולל הפרדה פיזית יסודית של הטריכומות מרקמת הצמח. שלב זה יכול להתבצע על ידי שימוש בקרח יבש5, חרוזי זכוכית עם מכשיר מסחרי 6,7, טחינת החומר הצמחי כנגד מסננת רשת8, או ערבול רקמת הצמח בחיץ בידוד9. השלב השני כולל הפרדה מעודנת יותר של הטריכומות המעניינות משאריות הצמח המיקרוסקופי ו/או מסוגי הטריכומות האחרים. שלב זה יכול להתבצע באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות 8,10 או מסננות בגדלים שונים 7,9. בשל הרגישות הקיצונית של RNA ברקמות מעובדות לחומרים משפילים, שני שלבים עוקבים אלה מתבצעים בדרך כלל בתווך בידוד קר כקרח, לעתים קרובות בנוכחות מעכבי חלבון4.
פרוטוקולי בידוד טריכומות קונבנציונליים דורשים, בנוסף לטמפרטורות הקרות כקרח, כמויות גדולות של אמצעי בידוד כדי להבטיח הליך חילוץ יעיל. השילוב של רכיבים אלה גורם לתהליך בידוד מפרך וגוזל זמן המעכב תפוקה גבוהה. הצגת פרוטוקול בידוד טריכומות חלופי פשוט וידידותי למשתמש עשויה אפוא להועיל להיבטים שונים הקשורים לאפיון הטריכומות. המאמר הנוכחי נועד להציע פרוטוקול חלופי לבידוד טריכומות קפיטט גבעול ובלוטות ססיל מקנאביס סאטיבה על ידי שילוב ושילוב של מספר אלמנטים מהפרוטוקולים הקונבנציונליים. יסודות אלה כוללים קרח יבש5, העברת הטריכומות דרך מספר מיקרו-מסננות עם גודל נקבוביות קטן 7,9, והחלפת חנקן נוזלי (LN) בתווך הבידוד8.
החידוש של פרוטוקול בידוד הטריכומות הנוכחי, בהשוואה לפרוטוקולים קונבנציונליים, בא לידי ביטוי במספר דרכים. פרוטוקול זה נוח, שכן הוא אינו דורש רכיבים מסוכנים. ההליך יכול להתבצע במעבדה עם אמצעי זהירות מינימליים ומאפשר תפוקה גבוהה. החלפת LN במדיום בידוד הנוזלים הסטנדרטי מבטיחה את שלמות הטריכומות לאורך כל תהליך הבידוד, ומאפשרת ניתוח שעתוק עוקב. עם סובלימציה של LN וקרח יבש, הטריכומות המבודדות נותרות ללא שאריות מזיקות. יתר על כן, הנטייה של LN לסובלימציה בטמפרטורת החדר מאפשרת שימוש נדיב בו לאורך כל הפרוטוקול. לעומת זאת, שימוש בכמויות גדולות של אמצעי בידוד קונבנציונלי יוצר קשיים מעשיים בטיפול בו. לבסוף, הפרוטוקול מקטין את ההפרדה של תא הדיסק ממבנה הראש השביר הנותר של הטריכומה הבלוטתית, ומאפשר שמירה על תכולת מרחב הראש.
פרוטוקול זה מוצג בצורה מפורטת שלב אחר שלב שנועד לסייע לפרקטיקה הטכנית של בידוד טריכומות קפיטט בלוטות C. sativa. הפרוטוקול מספק זרימת עבודה ניתנת לניהול המביאה לטריכומות מבודדות עם ריכוז גבוה וטוהר המתאימים לאנליזה מולקולרית במורד הזרם.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהשוואה לפרוטוקולי בידוד הטריכומות הקיימים כיום, שני שינויים עיקריים מתוארים בפרוטוקול הנוכחי. אלה כוללים ניתוק של הטריכומות מהחומר הצמחי באמצעות קרח יבש בשלב הראשוני והחלפת LN בתווך החיץ הנוזלי הנפוץ. השינוי הראשון לטיהור טריכומות C. sativa מבוסס על פרוטוקול מוקדם יותר שהציג שימוש בקר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים על תמיכה כספית מחברת CannabiVar Ltd. כל החומר הצמחי סופק בנדיבות על ידי פרופ’ חיננית קולטאי ממרכז וולקני.
Materials
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
