Den præsenterede protokol beskriver en ligetil tilgang til screening af proteinkrystalliseringsbetingelser og krystalvækst ved hjælp af en 96-brønds dialyseplade med høj kapacitet. Anvendelsen af dialysatorrør til storskala vækst af mikrokrystaller er også demonstreret til seriel krystallografi og MicroED-applikationer.
Forståelse af struktur-funktionsforholdet mellem makromolekyler, såsom proteiner, på molekylært niveau er afgørende for biomedicin og moderne lægemiddelopdagelse. Til dato er røntgenkrystallografi fortsat den mest succesrige metode til løsning af tredimensionelle proteinstrukturer ved atomopløsning. Med de seneste fremskridt inden for seriel krystallografi, enten ved hjælp af røntgenfrie elektronlasere (XFEL’er) eller synkrotronlyskilder, har proteinkrystallografi udviklet sig til den næste grænse, hvor evnen til at erhverve tidsopløste data giver vigtig mekanistisk indsigt i biologiske molekylers opførsel ved stuetemperatur. Denne protokol beskriver en ligetil HTP-arbejdsgang (high-throughput) til screening af krystalliseringsbetingelser ved brug af en 96-brønds dialyseplade. Disse plader følger Society for Biomolecular Screening (SBS) standard og kan let opsættes ved hjælp af ethvert standard krystalliseringslaboratorium. Når optimale forhold er identificeret, kan store mængder krystaller (hundredvis af mikrokrystaller) fremstilles ved hjælp af dialysatoren. For at validere robustheden og alsidigheden af denne tilgang blev fire forskellige proteiner krystalliseret, herunder to membranproteiner.
I løbet af det sidste århundrede har røntgenkrystallografi været afgørende for at belyse og forstå struktur-funktionsparadigmet for biologiske makromolekyler. Til dato er det fortsat en af de mest succesrige metoder til at belyse atomopløsningsstrukturer af mange unikt forskellige proteiner, der er afgørende for den grundlæggende forståelse af cellebiokemi, medicin og tidlig lægemiddelopdagelse 1,2. Imidlertid forbliver proteinkrystallisering en flaskehals i studiet af mange proteinmål, især membranproteiner og store proteinkomplekser3. Derfor betragtes proteinkrystallisation næsten altid som en kunst på grund af de arbejdskrævende trial-and-error-tilgange, der anvendes 4,5,6.
Et udfældningsmiddel tilsættes sædvanligvis til en proteinopløsning ved høj koncentration for at danne et velordnet, regelmæssigt og gentagende gitterarrangement af proteinmolekyler, kendt som krystaller. Under gunstige betingelser, såsom temperatur, pH, koncentration og bundfaldsmiddel, dannes der til sidst en overmættet opløsning efterfulgt af krystalkimdannelse og vækst 7,8. Selvom der har været mange fremskridt inden for krystalliseringsforsøgsopsætninger, overvejende med udviklingen af robotsystemer med høj kapacitet og tilgængeligheden af færdige “sparsomme matrix” -skærme, har de generelle tilgange til proteinkrystallisering stort set været uændrede gennem årene. Almindelige eksperimentelle proteinkrystalliseringsteknikker inkluderer dampdiffusion (hængende dråbe og siddende dråbe)9, mikrobatch (under olie)10,11, diffusion med fri grænseflade (mikrofluidiske enheder)12 og dialyse (ved hjælp af knapper og andre teknikker)13,14,15. Imidlertid findes der også andre mere specialiserede opsætninger, såsom mesofasemetoder til krystallisering af membranproteiner16,17. Mens størstedelen af røntgenproteinstrukturer deponeret i proteindatabanken hidtil er blevet løst gennem krystallisering ved dampdiffusionsmetoder 6,18, synes andre tilgange, såsom krystallisering ved dialyse, at være underudnyttede, sandsynligvis på grund af de praktiske aspekter relateret til deres eksperimentelle opsætning.
Krystallisering ved dialyse er simpelthen afhængig af langsom diffusion af opløste stoffer (bundfældningsmidler, ioner, additiver og buffere) gennem en semipermeabel membran, der samtidig forhindrer proteinmolekyler i at cirkulere. På denne måde bringes proteinopløsningen langsomt i ligevægt, hvor bundfaldet når den nødvendige koncentration til krystallisering. Systemets kinetik afhænger af temperatur, udfældningskoncentration og cellulosemembranens molekylvægtsafskæring (MWCO)19. Til dato har den mest populære krystalliseringsopsætning ved dialyse været at bruge mikrodialyseknapper lavet af gennemsigtige akrylplader. Disse nedsænkes normalt i reservoirer (for det meste ved hjælp af dampdiffusionshængende dråbeplader), der indeholder krystallisationsfældningsopløsningerne. Denne metode med lavere kapacitet kræver imidlertid også specifik samling for at forsegle proteinopløsningen i dialysemembranen placeret over knapkammeret, som illustreret i figur 1. Desuden er luftbobler fanget mellem dialysemembranen og proteinopløsningen et hyppigt problem, der forringer krystalvækst. En anden begrænsning ved metoden er prøvekravene, hvorved meget højere koncentrationer og volumener er nødvendige sammenlignet med dampdiffusionsmetoder for at imødekomme dialyseknapperne. Derfor er krystallisering ved hjælp af mikrodialyseknapper blevet opfattet som en utiltalende metode, især for vanskelige mål som membranproteiner, hvis rensningsudbytter er frustrerende lave. For nylig er mikrofluidiske enheder blevet udviklet til at lette proteinkrystallisation ved dialyse15. Disse chips er også designet til at have høj røntgengennemsigtighed med lav baggrund, hvilket gør det muligt at bruge chipsene til in situ-dataindsamling ved stuetemperatur, hvilket eliminerer besværet ved høst og kryokøling af krystaller. På trods af disse fremskridt er tilgangen stadig meget lav gennemstrømning og dyr.
Figur 1: Skematisk gengivelse af krystallisering ved dialyse ved hjælp af dialyseknapper. (A) Skematisk gengivelse af en krystalliseringsdialyseknap. (B) Proteinopløsningen tilsættes til mikrodialyseknapkammeret. (C) Dialysemembranen holdes fast på mikrodialyseknappen ved hjælp af en gummiring (O-ring), der påføres via en applikator. D) Dialyseknappen er klar til at blive nedsænket i beholderen indeholdende krystallisationsopløsningen (dialyseopløsning) som vist i punkt E. Hætteglasset med knappen til nedsænkning i dialyse skal være forseglet for at undgå fordampning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Her præsenteres en ligetil protokol til screening af proteinkrystalliseringsbetingelser og krystalvækst ved hjælp af dialysepladen med 96 brønde med høj kapacitet. Disse engangsplader er konstrueret til at blive brugt på samme måde som dampdiffusionskrystallisationspladerne (pipette derefter forsegling), som vist i figur 2. Pladerne kan rumme op til 3,2 μL protein og 350 μL dialyseopløsning. Hver brønd har en separat regenereret cellulosemembran for at forhindre krydskontaminering mellem brøndene. Opsætningen tager ca. 10 minutter at gennemføre og kræver ikke noget specialudstyr udover hvad der findes i alle standardkrystalliseringslaboratorier. Fire forskellige proteiner, herunder to membranproteiner, bruges til at demonstrere og validere denne tilgang som en effektiv metode til high-throughput (HTP) proteinkrystallografi.
Figur 2: Krystalliseringsproces ved hjælp af mikrodialysepladen. (A) Fjernelse af den røde klæbende “dækfilm”. (B) Dispensering af proteindråberne i hver af dråbehullerne. (C) Brøndene er dækket af UV “dækfilm”. (D) Pladen vendes på hovedet, så dialyseopløsningerne (eller krystalliseringsskærmen) tilsættes. E) Pladen forsegles og inkuberes. (F,G) Mikroskopinspektion af dråberne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Anvendelsen af denne krystallisering ved dialyseprotokol blev demonstreret ved anvendelse af 0,5 ml dialysatorrøret (figur 3) til storskala (hundreder til tusinder) produktion af mikrokrystaller, egnet til state-of-the-art dataindsamlingsmetoder såsom seriel krystallografi på begge XFEL-faciliteter 20,21,22,23,24 og synkrotroner25,26,27 , samt for MicroED28,29,30 tilgange.
Figur 3: Storskala mikrodialysekrystallisation ved hjælp af dialysatorrøret. (A) Skematisk gengivelse af 0,5 ml dialysatorrøret. B) Set fra siden af et bægerglas indeholdende krystallisationsopløsningen og det flydende rørstativ, der indeholder et dialysatorrør. Klik her for at se en større version af denne figur.
I øjeblikket er krystallisering ved dialyse den mest underudnyttede krystalliseringsmetode, nemlig på grund af den lave gennemstrømning og kedelige karakter af de eksisterende tilgange, såsom mikrodialyse med knapper. Her følger en enkel, men robust protokol en HTP-arbejdsgang for proteinkrystalvækst ved dialyse gennem en kommercielt tilgængelig mikrodialyseplade og dialyserør. Afhængigt af målproteinet leveres mikrodialysepladen og dialysatorrøret, der anvendes i proceduren, med et valg af en dialysemembran med en 3, 5, 10 eller 30 kDa MWCO. Protokollen kan let opsættes i enhver standard krystalliseringsfacilitet og har den store fordel, at den kan anvendes på både opløselige proteiner og membranproteiner. Imidlertid blev protein-protein og protein-nukleinsyrekomplekser ikke testet under denne protokol.
Som i enhver krystalliseringsmetode ved dialyse er volumenforholdet mellem proteinprøven og dialyseopløsningen kritisk. I denne protokol anbefales et forhold på 1:100 mellem prøven og dialyseopløsningen, men da mikrodialysepladen tillader en maksimal kapacitet på 350 μL dialyseopløsning, kan disse forhold undersøges for at opnå krystalhits. Et volumen på 1-2 μL protein anvendes i den præsenterede protokol ved opsætning af krystallisationsplader. Dette er for at sikre, at dråber indstilles nøjagtigt med en manuel multikanalpipette. Ved at bruge elektroniske pipetter (multikanals eller gentagne dispenseringspipetter) eller HTP-væskedispenseringsrobotter kan dråber med lavere volumener opnås nøjagtigt, hvilket sænker den nødvendige mængde protein. På grund af de relativt lave mængder dialysebuffer, der kræves af mikrodialysepladen (i modsætning til andre konventionelle dialysemetoder), er det desuden muligt (uden omfattende brug af ressourcer) at udforske store kemiske rum, ikke kun ved hjælp af kommercielt tilgængelige krystalliseringsskærme, men også med optimeringsskærme (designet omkring den oprindelige krystalliseringstilstand).
Et kritisk trin i den præsenterede HTP-procedure er rettidig anvendelse af små proteinvolumener (0.50-3.2 μL pr. Tilstand) til dialysepladen for at begrænse dehydrering og prøvetab. Dette kan let afhjælpes ved hjælp af en multikanalpipette, en gentagen dispenseringspipette eller et robotkrystalliseringssystem. Den lange inkubationstid, såsom mere end 2 uger, af pladerne ved 20 °C kan føre til dehydrering af proteindråberne eller beskadigelse af de nyligt dannede krystaller. Opbevaring af dialysepladerne inde i et befugtningskammer eller en forseglbar pose kan lindre denne effekt. Derudover anbefales det at bruge sterile materialer og teknikker for at undgå bakterievækst.
Som nævnt i indledningen er området for proteinrøntgenkrystallografi for nylig blevet revolutioneret gennem udvikling af nye og eksisterende krystalliseringsteknikker, moderne tilgange til levering af krystalprøver, nye generationer af røntgenkilder og nye sofistikerede metoder til dataindsamlingog behandling 36 ,37,38. Derfor har fremkomsten af stuetemperatur seriel mikrokrystallografi, enten udført ved hjælp af XFEL’er eller synkrotronlyskilder, vist sig at være et bemærkelsesværdigt værktøj inden for strukturel biologi, specifikt inden for membranproteiner39. Imidlertid kræves tusindvis af mikrokrystaller for at generere nok data til en robust strukturløsning, hvilket ikke er en let opgave (i det mindste ved konventionelle krystalliseringsmetoder). Dialysekrystalliseringsmetoden, der er beskrevet her, muliggør produktion af et stort antal mikrokrystaller. Når krystallisationsbetingelsen for fremstilling af mikrokrystaller (1-10 μm) er blevet bestemt ved anvendelse af en mikrodialyseplade, kan der fremstilles store mængder mikrokrystaller med høj densitet ved hjælp af 0,5 ml dialysatoranordningen (figur 5). Disse krystaller er ideelle til dataindsamling ved hjælp af faste mål eller flydende jetprøveleveringssystemer 27,40. Krystaller opnået ved denne metode kan også være passende til MicroED-applikationer. Det kan dog være nødvendigt at fræse disse ned til en passende størrelse og tykkelse til denne specifikke anvendelse, da elektroner interagerer meget stærkere med krystaller end røntgenfotoner41.
Afslutningsvis tilføjer krystalliseringen ved dialysetilgang, der er beskrevet her, de udviklende strategier inden for proteinkrystallisering til strukturbestemmelse og udvider spektret af indsatser, der kan anvendes til at bestemme nye proteinmål, der tidligere har været mislykkede med andre konventionelle metoder.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender finansiering fra Storbritanniens Department of Business, Energy and Industrial Strategy (BEIS). Vi takker Alex R. Jones og Mike Shaw fra National Physical Laboratory for deres feedback på manuskriptet.
0.2 mL tubes | Thermo Scientific | AB0620 | For aliquoting protein solutions. |
0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17823———-K | Surfactant-free cellulose acetate filters. For filtering dialysis solutions. |
0.22 µm membrane filters | Millipore | GSTF04700 | Membrane filters for filtering large volumes of buffers |
12-channel, variable 0.5 – 10 µL Research plus pipette | Eppendorf | 3125000028 | For dispensing protein drops onto the Diaplate. |
12-channel, variable 30 – 300 µL Eppendorf Research plus pipette | Eppendorf | 3125000060 | For dispensing dialysis solutions on the Diaplate reservoirs. |
20 mL syringe | Fisherbrand | 15889152 | For use with syringe filters. |
96 well 2.2 mL deep-well plates | Thermo Scientific | AB0788 | Polypropylene deep-well storage plates; for preparing screens using the Hamilton Microlab STARlet. |
Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000565 | With rotor FA-24×2 with a maximum g-force of 21,300 x g. |
Diacon dialyser | SWISSCI | W72010 | Dialyzer tubes with a regenerated cellulose membrane with a molecular weight cut-off of 10 kDa. Ideal for protein solutions of up to 0.5 mL. |
Diaplate 96-well plate | SWISSCI | W82010 | Microdialysis plate. The Diaplate consists of two sides with a regenerated cellulose membrane in-between with a molecular weight cut-off of 10 kDa. |
Falcon 50 mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | For holding dialysis solutions. |
Floating rack | SWISSCI | n/a | Included in the Diacon kit |
Floor-standing vibration-free incubator | Molecular Dimensions | MD5-01 | 400 L temperature-controlled incubator set to 20 °C. |
Leica M205 C stereo microscope | Leica | Planapo 1.0x objective, 7.8x – 160x zoom range with DMC 4500 camera | |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 62971 | Lyophilized protein |
Memgold2 | Molecular Dimensions | MD1-64 | Sparse-matrix screen |
Microlab STARlet | Hamilton | n/a | Liquid handler system. |
Reservoir cover film | SWISSCI | n/a | Included in the Diaplate kit |
Reusable bottle top filter | Thermo Scientific | DS0320-5045 | For fitering large volumes of buffers, for use with 0.22 µm membrane filters |
Sealing paddle | SWISSCI | n/a | Included in the Diaplate kit |
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma Aldrich | T7638 | Lyophilized protein |
UV cover film | SWISSCI | n/a | Included in the Diaplate kit |