글루칸 포스파타제의 기질 결합을 측정하기 위한 Concanavalin A 기반 침강 분석
Summary
이 방법은 글루칸 포스파타제와 아밀로펙틴의 결합 친화도를 정량화하기 위한 렉틴 기반 시험관 내 침강 분석을 설명합니다. 이 공동 침강 분석은 글루칸 포스파타제 기질 결합을 측정하는 데 신뢰할 수 있으며 다양한 가용화된 글루칸 기질에 적용할 수 있습니다.
Abstract
글루칸 포스파타제는 동물의 글리코겐 및 식물의 전분과 같은 글루칸 기질을 탈인산화하는 이중 특이성 포스파타제(DSP)의 더 큰 계열에 속합니다. 모델 글루칸 기질을 가진 글루칸 포스파타제의 결정 구조는 DSP와 탄수화물 결합 도메인으로 만들어진 뚜렷한 글루칸 결합 계면을 나타냅니다. 그러나 생리학적으로 관련된 기질과의 글루칸-글루칸 포스파타제 상호작용의 정량적 측정은 글루칸 포스파타제 효소 계열의 생물학적 이해와 에너지 대사 조절의 기본입니다. 이 원고는 다른 글루칸 기질에 대한 글루칸 포스파타제의 기질 결합 친화도를 검출하도록 설계된 Concanavalin A(ConA) 기반 시험관 내 침강 분석을 보고합니다. 개념 증명으로서, 글루칸 포스파타제 Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) 및 아밀로펙틴의 해리 상수(KD)를 측정하였다. SEX4 돌연변이 및 글루칸 포스파타제 효소 계열의 다른 구성원의 특성화는 단백질-탄수화물 상호 작용의 차등 결합을 평가하기 위한 이 분석의 유용성을 추가로 입증합니다. 이러한 데이터는 광범위한 전분 및 글리코겐 상호작용 단백질을 특성화하기 위한 이 분석의 적합성을 입증합니다.
Introduction
글루칸 포스파타제는 단백질 티로신 포스파타제(PTP) 슈퍼패밀리1 내에서 이중 특이성 포스파타제(DSP)의 기능적으로 다양한 서브패밀리의 구성원입니다. 그들은 광범위하게 발산하는 광합성 유기체, 인간, 척추 동물, 일부 무척추 동물 및 원생 생물을 포함한 대부분의 생명체에서 발견되었습니다 2,3,4. 식물에는 전분 과잉4 (SEX4), 성 4 (LSF1) 및 성 4 (LSF2) 5,6,7과 같은 세 가지 알려진 글루칸 포스파타제가 포함되어 있습니다. 글루칸 포스파타제가 결핍된 식물은 일시적인 전분 분해 및 잎의 전분 축적 비율이 감소합니다 8,9. Laforin은 척추 동물과 인간의 글리코겐을 탈인산화하는 글루칸 포스파타제 계열의 창립 멤버입니다 3,10. 라포린의 돌연변이는 신경퇴행성 라포라병을 유발하는데, 이는 치명적인 상염색체 열성 형태의 간질이다11. 글루칸 포스파타제는 글리코겐과 전분 대사에 필요하며 식물의 전분 함량을 조절하고 신경퇴행성 라포라병을 치료하는 중요한 효소로 부상했습니다12,13. 모델 글루칸 기질을 가진 글루칸 포스파타제에 대한 최근의 X선 결정학 연구는 기질 결합 및 글루칸 탈인산화의 촉매 메커니즘에 대해 밝혔습니다14,15,16,17. 그러나 글루칸 포스파타제가 생리학적 기질에 어떻게 결합하는지에 대한 현재의 이해는 불완전합니다.
전분은 80%-90% 아밀로펙틴과 10%-20% 아밀로오스로 만들어진 포도당의 불용성 중합체입니다18. 식물 글루칸 포스파타제의 기질은 글리코겐 및 전분 과립과 같은 인산화된 탄수화물 분자입니다. 인산화된 글루코실 잔기는 1:600 포스페이트:글루코실 잔기 비율로 존재한다. 흥미롭게도, 인산염은 아밀로펙틴 분자에만 존재한다19. 주요 식물 글루칸 포스파타제 SEX4는 전분 과립에 작용하여 아밀로펙틴 분자를 탈인산화합니다. 구조 유도 돌연변이 유발 연구와 결합된 SEX4의 X선 결정 구조는 글루칸 구조 내의 다양한 위치에 대한 SEX4의 고유한 기질 특이성을 입증했습니다15. 우리는 최근에 SEX4의 생물학적으로 관련된 활성이 가용화된 아밀로펙틴 기질에 작용할 때만 관찰될 수 있음을 보여주었습니다20. 그러나 글루칸-SEX4 상호작용을 이해하는 것은 기질의 구조적 복잡성, 더 넓은 결합 특이성, 단백질과 그 기질 사이의 낮은 결합 친화도로 인해 어려운 것으로 입증되었습니다. 이러한 문제는 등온 적정 열량측정법(ITC), 핵자기 공명(NMR) 분광법 및 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 기반 분석과 같은 단백질-리간드 상호작용에 일반적으로 사용되는 방법을 활용하는 능력을 방해했습니다.
흥미롭게도 탄수화물-단백질 상호 작용에 대한 우리의 이해의 대부분은 렉틴을 연구하는 데서 비롯되었습니다. 콘카나발린 A(ConA)는 원래 잭빈에서 추출한 콩과 식물 렉틴 계열의 단백질입니다. ConA는 높은 특이성으로 탄수화물을 결합하므로 약물 표적화 및 전달 응용 분야에 사용하기에 유리합니다. 비환원성 α-D-만노실 및 α-D-글루코실을 함유하는 다양한 기질에 대한 ConA의 결합이 광범위하게 연구되었다19,20. 상업적으로 이용 가능한 ConA-결합 세파로스 비드는 일반적으로 당단백질과 당지질을 정제하는 데 사용된다21. ConA는 포도당 잔기의 C3, C4 및 C6 하이드록실 그룹을 통해 이러한 글루칸에 결합합니다. ConA-Sepharose 비드는 또한 글리코겐-단백질 및 전분-단백질 상호작용의 결합을 측정하는 데 성공적으로 사용되었습니다22,23. 이 연구에서 우리는 ConA-Sepharose 비드를 사용하여 글루칸 포스파타제-아밀로펙틴 상호작용의 결합 특이성을 측정하기 위한 결합 분석을 개발했습니다.
이전에는 글루칸 포스파타제 기질 결합 능력 14,20,24를 평가하기 위해 ConA 기반 침강 분석이 사용되었습니다. 이 연구에서는 글루칸-글루칸 포스파타제와 탄수화물 상호작용의 결합 친화도를 결정하는 새로운 방법을 개발하는 데 동일한 전략이 사용되었습니다. 이 방법은 또한 다양한 가용화 탄수화물-단백질 상호 작용을 조사하는 데 이점이 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 글루칸-글루칸 포스파타제 상호작용의 결합 친화도를 측정할 수 있는 새로운 시험관 내 침강 분석의 성공적인 개발을 보여줍니다. 분석 설계는 포도당의 하이드록실 잔기를 통해 글루칸에 대한 렉틴 ConA의 특이적 결합을 활용하여 가용화된 탄수화물 기질을 세파로스 비드에 간접적으로 포획합니다. 이를 통해 원심분리를 통해 결합된 단백질 분획과 결합되지 않은 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 과학 재단 상 MCB-2012074의 지원을 받았습니다. 저자는 귀중한 토론과 지원을 해준 플로리다 대학교 생화학 및 분자 생물학과의 Craig W. Vander Kooi 박사에게 감사드립니다. 저자는 또한 플로리다 대학교 생화학 및 분자 생물학과의 Matthew S. Gentry 박사에게 그의 지원에 감사드립니다. 웨스턴 블롯 이미징을 위해 LICOR C-digit 블롯 스캐너를 사용할 수 있도록 허락해 주신 Skidmore College Neuroscience 프로그램의 의장인 Sara Lagalwar 박사에게 감사드립니다.
Materials
| 6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP | Therm Fisher Scientific | MA1-21315-HRP | |
| Biorad gel electrophoresis and Western blot kit | Biorad | 1703930 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 208291 | |
| C-Digit blot scanner | LICOR | 3600-00 | Blot scanner |
| Complete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| Concanavalin A-sepharose beads | Sigma-Aldrich | C9017 | This product contains in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol |
| Centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | Version 8.0 | Data analysis software |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H8651 | |
| Image Studio | LICOR | 3600-501 | Acquisition Software |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | PI28312 | |
| Potato amylopectin | Sigma-Aldrich | A8515 | |
| Precast SDSPAGE Gels | Genscript | M00653S | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | MP1TWEEN201 | |
| Westernsure premium chemiluminescence substrate | LI-COR | 926-95000 |
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