기능성 파골세포와 인간 말초 혈액 CD14⁺ 단핵구의 분화

스코틀랜드 국립 수혈 서비스 (에딘버러)에서 얻은 버피 코트와 NHS 혈액 및 이식 (뉴캐슬)에서 얻은 백혈구 원뿔은 완전히 동의 한 NHS 헌혈자로부터 완전히 익명화 된 (식별 불가능한) 형태로 글래스고 대학 연구원에게 제공됩니다. 버피 코트와 백혈구 원뿔 혈액 성분은 스코틀랜드 또는 영국의 NHS 헌혈 센터에서 제공되는 NHS 표준 헌혈에서 생산됩니다. 헌혈자는 승인된 의학 연구에 사용하기 위해 표준 NHS 임상 실습에서 사용되지 않은 잉여 혈액에 대해 헌혈 시 정보에 입각한 동의를 제공합니다. NHS 연구 윤리위원회의 윤리적 승인과 이러한 헌혈을 사용하기 위해 서명 된 기증자 동의서는 NHS 헌혈 서비스에서 보유합니다. 승인된 의학 연구에서 이러한 동의된 헌혈에 접근하고 사용하기 위한 승인은 National Blood Transfusion Service(스코틀랜드) 및 NHS Blood and Transport(영국)의 표준 내부 신청 및 검토 프로세스를 사용하여 구하고 획득했습니다. 승인된 의학 연구에 혈액 성분을 사용하기 위해 더 이상 NHS REC 승인 또는 글래스고 대학교 윤리 위원회 승인이 필요하지 않았습니다. 1. 시작하기 전 일반 참고 사항 피를 사용하는 모든 작업을 주의해서 진행하십시오. 샘플에 존재할 수 있는 다양한 감염원의 잠재적 위험을 고려하십시오. 장갑과 실험복을 착용한 상태에서 무균 상태의 생물안전 실험실에서 모든 작업을 조심스럽게 수행하십시오. 현지 지침에 따라 생물학적 안전 폐기를 수행하십시오. 현지 당국 규정에 따라 샘플을 채취하기 전에 적절한 동의와 윤리적 승인을 받으십시오. 일반적으로 1mL의 신선한 혈액은 100만 개의 PBMC를 생성하며 CD14+ 단핵구는 PBMC의 약 10%-30%를 차지합니다. 이에 비해 백혈구 원뿔 10mL에는 5 x 10 8-15 x 108 PBMC가 포함될 수 있습니다. PBMC 격리에 대한 자세한 내용은 이전 프로토콜37을 참조하십시오. 2. 전혈에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 분리 건강한 기증자로부터 필요한 양의 신선한 혈액을 리튬 헤파린 수집 튜브에 수집합니다.참고: 적절한 항응고제가 포함된 다른 수집 튜브(예: 나트륨 헤파린 튜브)도 사용할 수 있습니다. 더 높은 세포 수를 위해 백혈구 원뿔 또는 버피 코트를 사용할 수 있습니다. PBMC를 분리하려면 혈액을 새 50mL 튜브로 옮기고 신선한 혈액 또는 백혈구 원뿔/버피 코트에 대해 각각 1:1 또는 1:3 비율로 멸균된 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 희석합니다. 반전으로 세포를 여러 번 부드럽게 혼합하십시오. 3mL의 밀도 구배 배지가 들어 있는 15mL 튜브를 준비합니다. 밀도 구배 배지 위에 희석된 혈액 8-10mL를 천천히 겹치고 브레이크 없이 실온(RT)에서 30분 동안 400 x g 에서 원심분리합니다.알림: 혼합을 방지하기 위해 밀도 구배 배지 위에 혈액을 조심스럽게 바르십시오. 혼합하면 PBMC가 손실될 수 있습니다. 파스퇴르 피펫으로 최상층(혈장 포함)을 조심스럽게 버리고 PBMC(흰색, 고리 모양 구조)가 포함된 하부 간기 층을 수집한 다음 이 층을 새 50mL 튜브로 옮깁니다. 세포를 멸균된 1x PBS로 최대 50 mL까지 현탁하고, 완전 브레이크로 RT에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 잔류 밀도 구배 배지를 세척합니다. 잔류 혈소판을 제거하려면 브레이크 없이 RT에서 200분 동안 10 x g 에서 추가로 느린 회전으로 이 과정을 반복합니다. 선택 사항: 적혈구의 이월을 제거하려면 적혈구 용해 완충액(10x, 재료 표)을 증류수에 1:10으로 희석하고 희석된 완충액 3mL를 펠릿에 바릅니다. 혼합하고 3분 동안 배양합니다. 펠릿을 최대 50mL의 1x PBS로 세척하고 완전 브레이크를 사용하여 RT에서 300 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 분리 및 정제된 PBMC를 20mL의 1x PBS에 재현탁하고 혈구측정기를 사용하거나 다른 표준 방법에 따라 계산합니다.알림: 세포 희석 및 세포 계수 방법은 사용된 세포 밀도 및 계수 장치에 따라 적절하게 조정되어야 합니다. 3. PBMC에서 CD14+ 단핵구의 농축 제조업체의 프로토콜(재료 표)에 따라 인간 CD14+ 선택 키트를 사용하여 PBMC에서 CD14+ 단핵구를 분리합니다.참고: 고전적인 CD14+CD16- 단핵구는 OC 전구체35의 주요 공급원입니다. 대체 정제 방법을 고려할 수 있습니다. 1 x 107 PBMC를 적절한 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브(즉, 선택 키트 자석에 맞음)에 옮기고 300 x g 에서 5분 동안 셀을 펠릿화합니다. 상층액을 버리고 세포 분리 완충액(PBS, 2% 소 태아 혈청[FBS], 1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산[EDTA])에 세포 펠릿을 1 x 108 cells/mL의 최종 농도로 재현탁하고 뚜껑을 덮은 상태에서 100μL당 항체 칵테일 10μL와 함께 10분 동안 배양합니다.참고: 세포는 1 x 108 cells/mL에서 재현탁됩니다. 그에 따라 볼륨을 조정하십시오. 배양 후 자성 나노입자 비드 100μL당 10μL를 넣고 뚜껑을 덮은 상태에서 3분간 배양합니다.참고: 항체 칵테일과 마그네틱 비드의 부피를 조정하여 10μL/mL의 농도를 얻습니다. 세포 분리 완충액으로 부피를 2.5mL로 채우고 튜브를 자석(뚜껑 없음)에 넣고 3분 동안 배양합니다. 튜브가 여전히 자석에 있는 동안 반전에 의해 한 번의 연속 이동으로 음의 세포 집단을 버립니다.알림: >2 x 108 PBMC와 더 큰 자석을 사용하는 경우 제조업체의 지침에 따라 세포 분리 버퍼로 최대 5mL 또는 10mL를 채웁니다. 자석에서 튜브를 제거하고 자성 비드에 부착된 농축 CD14+ 단핵구를 2.5mL의 세포 분리 완충액에 재현탁하여 세척합니다. 이전과 같이 자석 내부에서 3분 동안 배양하고 음수 분획을 버리고 한 번 더 반복합니다. 수집된 모든 세포를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 버리고, 세포를 5mL의 알파 최소 필수 배지(α-MEM; 재료표) 1% L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신(완전한 α-MEM) 및 10% FBS로 보충됩니다.참고: 유세포 분석을 통한 농축 후 순도 검사가 권장되며 ≥96% 순도를 기대해야 합니다. 추가의 세척 단계(단계 3.6)는 순도를 증가시킬 수 있다. 4. OC in vitro 분화 hemacytometer를 사용하여 농축된 CD14+ 단핵구를 계산합니다. 세포를 300 x g 에서 5분 동안 펠렛화하고 10% FBS가 보충된 완전한 α-MEM에서 1 x 106 cells/mL로 재현탁합니다. OC를 분화하려면 최종 농도 25ng/mL의 M-CSF를 세포 현탁액에 추가합니다.참고: 1mL의 세포 현탁액에 대해 0.25μg/mL의 스톡 농도에서 100μL의 M-CSF를 추가합니다. 세포 현탁액을 균질화하기 위해 피펫팅으로 완전히 혼합하고 평평한 바닥 96웰 플레이트에서 100μL/웰의 최종 세포 밀도가 1 x 105 세포/웰이 되도록 플레이트합니다. 200μL/웰의 멸균 증류수를 도팅된 세포 주변의 웰에 추가하여 배양 시스템에서 배지 증발 및 가장자리 효과를 방지합니다. 세포를 5%CO2와 함께 37°C에서 약 18-20시간 동안 밤새 인큐베이션한다. 하룻밤 배양 후 P200 피펫을 사용하여 흡인하여 배지의 절반(50μL/웰)을 웰 바닥을 만지지 않도록 조심스럽게 제거하고 최종 농도 25ng/mL에 대해 10% FBS, 25ng/mL M-CSF 및 50ng/mL RANKL을 포함하는 신선하고 따뜻한 완전한 α-MEM으로 교체합니다알림: 배지 1mL의 경우 스톡 농도 0.25μg/mL에서 M-CSF 0.5μL과 RANKL 100μL을 추가합니다. 3일마다 배지를 교체하고 7-14일 동안 세포를 OC로 분화합니다(그림 1).참고: 배양 전반에 걸쳐 M-CSF 및 RANKL 농도를 일관되게 유지하십시오. 그림 1: OC 차별화 워크플로우. 7-14일 동안 M-CSF 및 RANKL이 있는 상태에서 PBMC에서 CD14+ 단핵구 분리 및 성숙한 OC로의 분화에 대한 개략도. RT = 실온. BioRender.com 로 만든 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 5. 파골세포에 대한 TRAP 염색 배지를 조심스럽게 제거하고 분화된 부착성 OC를 미리 준비된 고정액 100μL/well로 고정한 후 1분 동안 배양합니다. 부착 세포가 긁히지 않도록 웰 바닥을 만지지 마십시오.참고: 고정 용액은 구연산염 용액 12.5mL(TRAP 염색 키트에 포함), 아세톤 32.5mL, 37% 포름알데히드 5mL와 같이 준비됩니다. 300 μL의 멸균 증류수로 웰을 세 번 세척한다. 세척 후 접시를 두드려 말리십시오. 제조자의 지시에 따라 염색 용액을 준비한다 (재료의 표); 패스트 가넷 5μL와 아질산나트륨 5μL를 첨가하여 패스트 가넷 용액을 만듭니다. 반전으로 혼합하고 RT에서 3분 동안 배양합니다. 멸균 증류수 900μL, 나프톨 10μL, 아세테이트 용액 40μL, 타르타르산염 용액 50μL, 패스트 가넷 용액 10μL를 혼합하여 염색 용액 1mL를 준비합니다. 새로 준비된 염색 용액 100μL/well을 추가하고 플레이트를 37°C의 암실에서 20분 동안 배양합니다. 배양 후, 염색 용액을 반전으로 제거하고, 300 μL/well의 증류수로 플레이트를 3회 세척한다. 종이 타월에 접시를 두드려 여분의 물을 제거하십시오. 플레이트를 열어 두고 빛으로부터 보호하여 밤새 공기 건조시킵니다.알림: 건판은 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 때때로 잔류 완충액은 현미경으로 볼 수 있는 곰팡이의 발달을 촉진할 수 있습니다. 이것은 영향을받는 우물을 증류수로 씻고 다시 공기 건조시킴으로써 언제든지 제거 할 수 있습니다. 타일 옵션이 있는 명시야 현미경을 사용하여 10x 또는 20x로 이미지를 촬영하여 전체 웰 표면을 캡처합니다. 세포 계수기 플러그인이 있는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 3개 이상의 핵을 가진 TRAP+ 보라색 염색 세포로 식별된 OC를 수동으로 계산합니다.알림: 웰당 TRAP+ OC의 수는 기증자에 따라 다르며 ~200-1,600 OC/웰에서 다양할 수 있으며 평균 약 1,000 OC/웰입니다. 또한 데이터를 분석하려면 OC 번호를 3개의 서로 다른 웰(기술 복제)에서 결정해야 하며 각 조건 및 각 생물학적 복제물에 대해 평균을 계산해야 합니다. 6. 골흡수 분석 갓 농축된 CD14+ 단핵구를 1 x 105 세포/ 웰에서 인산칼슘으로 코팅된 96웰 골 분석 플레이트에 플레이트하고 4.1-4.8단계에 표시된 대로 7-14일 동안 OC를 분화하고 3일마다 배지를 교체합니다.참고: 상아질/상아 또는 소 피질 뼈 조각은 골 분석 플레이트 대신 사용할 수 있습니다. 그렇다면, 배양의 총 시간은 재 흡수 될 더 복잡한 기질 때문에 14-21 일로 연장되어야한다. 종료 시점에서, 우물의 바닥을 만지지 않도록 조심스럽게 배지를 제거하고, 10% 차아염소산나트륨 용액으로 세포를 용해시킨다. 증류수로 우물을 세 번 씻으십시오. 명시야 현미경을 사용하여 건판을 스캔하고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 흡수 피트의 획득 이미지를 분석/정량화합니다. 7. 액틴고리 형광염색 분리된 CD14+ 단핵구의 100μL/웰을 1 x 10 5 세포/웰의 세포 밀도 로 18웰 챔버 슬라이드에 플레이트합니다. 3일마다 배지를 교체하는 것을 포함하여 이전에 설명한 대로(4.1-4.8단계) M-CSF 및 RANKL이 있는 상태에서 OC를 구별합니다. 종료 시점에서, 배지를 부드럽게 제거하고, 예열된 PBS, pH 7.4의 200 μL/well로 각 웰을 2회 세척한다. 단계 사이에 우물을 말리지 마십시오. PBS에서 4% 포름알데히드 용액 100μL/웰로 샘플을 고정하고 부드럽게 흔들면서 오비탈 셰이커에서 RT에서 10분 동안 배양합니다.참고: 메탄올은 고정 과정에서 액틴을 방해할 수 있습니다. 따라서 메탄올 함유 고정제를 피하는 것이 가장 좋습니다. 바람직한 고정제는 메탄올이 없는 포름알데히드이다. 프로토콜의 이 단계에서 사용된 오비탈 셰이커는 10점 만점에 3점의 전력 설정으로 설정되었습니다. 200 μL/웰의 PBS로 2회 세척하고, PBS에 희석된 0.1% 트리톤 X-100 용액의 100 μL/웰로 세포를 투과시키고, 부드럽게 흔들면서 오비탈 셰이커에서 RT에서 10분 동안 배양합니다. PBS 200μL/well로 2회 세척합니다. 비특이적 결합을 차단하고 신호를 증가시키려면 2% 소혈청알부민(BSA)/PBS 용액으로 만든 차단 용액 100μL/웰을 추가합니다. RT에서 부드럽게 흔들면서 궤도 셰이커에서 20분 동안 배양합니다. 블로킹 용액을 제거하고 2% BSA/PBS 용액에 희석한 형광 공액 팔로이딘 용액 100μL/웰을 추가합니다. RT에서 부드럽게 흔들고 빛으로부터 보호하면서 궤도 셰이커에서 20분 동안 배양합니다.알림: 제조업체의 권장 사항에 따라 팔로이딘 염료의 농도를 조정하십시오. 200 μL/웰의 PBS로 2회 세척하고, 300 nM DAPI를 함유하는 PBS의 용액 100 μL/웰로 핵을 염색하고, 부드럽게 흔들고 빛으로부터 보호하면서 오비탈 셰이커에서 RT에서 10-15분 동안 배양한다.참고: DAPI를 증류수에 희석하여 14.3mM(5mg/mL) DAPI 원액을 만듭니다. 원액은 최종 농도 300 μM까지 더 희석된다. 마지막으로, 300 μM DAPI 용액을 PBS에서 300 nM의 최종 농도로 한 번 더 희석한다. 10-15분 후 DAPI 용액을 제거하고 100μL/웰 PBS로 교체합니다.알림: 선택한 챔버 슬라이드에 따라 적절한 양의 PBS(100웰 챔버 슬라이드의 경우 18μL/웰)와 함께 보관하거나 커버슬립과 적절한 장착 매체를 사용하여 슬라이드를 장착합니다. 챔버 슬라이드는 냉장고에 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다. 18웰 챔버 슬라이드의 경우 50-100 μL 염색 부피와 200-300 μL의 세척을 사용합니다. 그에 따라 다른 챔버 슬라이드 크기에 맞게 확장합니다. 증발을 방지하려면 배양 시간 동안 덮개를 덮은 용기 안에 보관하십시오. 오비탈 셰이커를 사용하는 것이 권장되지만 필수는 아닙니다. 적절한 면역형광 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 염색을 시각화하고 4x에서 40x 사이의 배율을 측정합니다. 8. 유세포 분석을 통한 성숙한 OC 및 OC 전구체의 농축 갓 농축된 CD14+ 단핵구를 1 x 106 cells/mL로 재현탁하고 위에서 설명한 것과 동일한 방식으로 M-CSF 및 RANKL이 있는 상태에서 성숙한 OC로 분화합니다(4.1-4.8단계).알림: 96웰 플레이트에서 더 큰 플레이트 크기로 확장할 때 표 1을 따르십시오. 이 부피는 1 x 106 cells/mL 용액에서 시작하여 계산되며 세포-세포 융합을 위한 최적의 밀도를 제공합니다. 7일째에, 웰을 따뜻한 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL를 1 mL(사용된 플레이트 크기에 의해 결정된 부피)의 아쿠타제를 첨가한다. 세포를 5%CO2 와 함께 37°C에서 20분 동안 인큐베이션한다. 배양 후 광학 현미경으로 플레이트를 확인하여 세포가 분리되었는지 확인합니다. 또한 플레이트의 모든 면을 두드리고 위아래로 피펫팅하여 세포를 분리합니다. 15mL 원뿔형 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다. 웰을 따뜻한 PBS(Ca2+ 없음, Mg2+ 없음)로 세척하고 세포 현탁액과 결합합니다. 대부분의 셀이 분리될 때까지 8.2-8.3단계를 한두 번 반복합니다.참고: 유세포 분석을 위해 표면 염색 전에 권장되는 방법인 Accutase는 매우 큰 OC를 분리하지 않습니다. 회수율은 ~50%-70%입니다. 세포를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 세포 펠릿을 PBS 1mL에 재현탁하고, 트립판 블루 배제로 세포를 계수합니다. 세포를 1 x 106 cells/mL로 재현탁하고 1 x 105 세포에 해당하는 100μL를 제거한 다음 해당 세포를 새 폴리프로필렌 시험관으로 옮깁니다. 200 μL의 세포 분류 완충액을 첨가하고, 이를 염색되지 않은 대조군으로 얼음 위에 따로 보관합니다. RT에서 1:750에서 10분 동안 희석한 살아있는/죽은 염료로 나머지 세포를 얼룩지게 하고 빛으로부터 보호합니다.알림: 높은 배경 염색을 피하기 위해 FBS가 없을 때 라이브/데드 염색을 수행해야 합니다. 살아있는/죽은 염색 세포 현탁액이 들어 있는 15mL 수집 튜브에 따뜻한 세포 분류 완충액(1x PBS, no Ca 2+, no Mg2+, 1% FBS 및 5mM EDTA)을 채우고 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.참고: 세포 덩어리를 방지하기 위해 분류 완충액에 고농도의 EDTA와 저농도의 FBS를 권장합니다. 1 x 105 셀에 해당하는 부피를 제거하고 OSCAR 아이소타입 제어를 위해 새 폴리프로필렌 테스트 튜브로 옮깁니다. 염색 및 세포 분류를 위해 나머지 모든 세포를 다른 폴리프로필렌 시험관으로 옮깁니다.알림: 폴리프로필렌 시험관은 셀이 폴리스티렌 관보다 이 관에 부착될 가능성이 적기 때문에 분류에 사용됩니다. 튜브를 400 x g 에서 5분 동안 회전시켜 세포를 펠릿화하고 반전으로 과잉 상청액을 버립니다. 표 2에 따라 제조된 항체 마스터 믹스 용액에 세포 펠렛을 재현탁한다. OSCAR 항체 대신 CD14 항체 및 OSCAR 이소타입 대조군으로 OSCAR 이소타입 제어 튜브를 염색합니다. 세포를 빛으로부터 보호하여 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 30분 후, 세포 분류 완충액 5개를 첨가하고, 4°C에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리하여 세포를 세척하였다. 300-1,000 μL의 저온 세포 분류 완충액에 세포를 재현탁하고 100μM 노즐이 장착된 유세포 분석 선별기를 사용하여 세포를 획득합니다.참고: OC는 매우 끈적끈적한 세포이므로 분류하기 전에 멸균된 70μm 멤브레인을 통해 여과하는 것이 중요합니다. OC 및 pre-OC를 CD14−OSCAR+로 게이트합니다. OSCAR 아이소타입 컨트롤 튜브를 기반으로 OSCAR+ 게이트를 설정합니다. 8°C에서 20% FBS가 보충된 완전한 α-MEM이 포함된 폴리프로필렌 시험관에서 분류된 세포를 수집합니다. 분류 후, RT에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 세포를 계수하고, 다운스트림 적용을 위해 재현탁합니다.참고: 일반적으로 ~1 x 105 개의 정렬된 pre-OC/OC를 얻으려면 10일에 도금된 ~10 x6 0 셀에서 시작합니다. 낮은 회수율은 아큐타제로 분리하는 동안 세포 손실과 염색 및 분류를 위한 처리에 의해 영향을 받습니다. 멸균 완충액과 시약을 사용하여 전체 절차를 수행하고 멸균 상태에서 작업하는 것이 좋습니다. 9. 미토콘드리아 활성에 대한 ATP 분석 이전에 설명한 것과 동일한 방식으로 M-CSF 및 RANKL의 존재 하에 농축된 CD14+ 단핵구를 96웰 플레이트에서 배양합니다(단계 4.1-4.8). 컨트롤로 사용하기 위해 4개의 추가 조건을 세 번 플레이트합니다. 제조업체의 설명서에 따라 발광 ATP 검출 분석 키트로 ATP 분석을 수행합니다. 간략하게, ATP 용액을 제조하기 위해, 10 mL의 기질 완충 용액을 동결건조된 기질에 첨가하고, 이를 RT에서 30분 동안 인큐베이션하도록 방치한다.참고: 세포 내 ATP 생산을 측정하기 위해 다양한 방법을 사용할 수 있습니다. 여기서, 발광에 의한 ATP 생산의 검출을 이용하였다. 인큐베이션 동안, 대조군을 다음과 같이 대조군 웰에 직접 첨가하고 첨가한다: 10 mM 및 100 mM의 2-데옥시-D-글루코스(2DG), 1 μM의 올리고마이신, 및 1 μM 올리고마이신과 조합된 100 mM 2DG. 5%CO2와 함께 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.참고: 2DG는 해당과정을 차단하는 반면 올리고마이신은 산화적 인산화 억제제입니다. 이 두 억제제를 결합하면 해당 과정과 산화적 인산화를 통해 ATP 생산이 완전히 손실되므로 ATP 분석을 위한 내부 제어 역할을 합니다. 10 mM 및 100 mM 2DG 대조군의 경우, 100 μL 배양 웰당 각각 0.5 μL 및 5 μL의 2M 2DG 저장 용액을 추가합니다. 1μM 올리고마이신의 경우 5mM 원액을 배지에서 1:100으로 희석하고 전용 대조군 웰에 2μL/웰을 추가합니다. 마지막 대조군의 경우 웰당 5μL의 2DG와 2μL의 희석된 올리고마이신 용액을 추가합니다. ATP 용액 50 μL를 각 웰에 첨가하여 반응을 중지시키고, 빛으로부터 보호하면서 5-10분 동안 700rpm의 진탕기 상에서 RT에서 인큐베이션한다. 상청액 100 μL를 ATP 분석에 특이적인 96-웰 백색 바닥 플레이트로 옮기고, 발광 판독기를 사용하여 플레이트를 판독하였다.