Differentiatie van functionele osteoclasten van humaan perifeer bloed CD14⁺ monocyten

Buffy-jassen verkregen van de Scottish National Blood Transfusion Service (Edinburgh) en leukocytenkegels verkregen van NHS Blood and Transplant (Newcastle) worden verstrekt aan onderzoekers van de Universiteit van Glasgow in een volledig geanonimiseerde (niet-identificeerbare) vorm van volledig instemmende NHS-bloeddonoren. De buffy coat en leukocyt kegel bloedcomponenten worden geproduceerd uit een NHS standaard bloeddonatie gegeven in een NHS bloeddonorcentrum in Schotland of Engeland. De bloeddonor geeft geïnformeerde toestemming op het moment van de bloeddonatie voor overtollig bloed dat niet wordt gebruikt in de standaard nhs-klinische praktijk om te worden gebruikt voor goedgekeurde medische onderzoeksstudies. De ethische goedkeuring van de NHS Research Ethics Committee en de ondertekende toestemmingsformulieren van de donor om deze bloeddonaties te gebruiken, worden bewaard door de NHS-bloeddonatiedienst. Goedkeuring voor toegang tot en gebruik van deze goedgekeurde bloeddonaties in goedgekeurde medische onderzoeksstudies werd gevraagd en verkregen met behulp van het standaard interne aanvraag- en beoordelingsproces van de National Blood Transfusion Service (Schotland) en NHS Blood and Transport (Engeland). Er was geen verdere NHS REC-goedkeuring of interne goedkeuring van de ethische commissie van de Universiteit van Glasgow vereist om de bloedbestanddelen te gebruiken voor de goedgekeurde medische onderzoeksstudies. 1. Algemene opmerkingen voor aanvang Ga voorzichtig te werk met al het bloed. Overweeg de potentiële gevaren van verschillende infectieuze agentia die in de monsters aanwezig kunnen zijn. Voer al het werk voorzichtig uit in het bioveiligheidslaboratorium onder steriele omstandigheden terwijl u handschoenen en laboratoriumjassen draagt. Voer bioveiligheidsverwijdering uit volgens de lokale richtlijnen. Verkrijg de juiste toestemming en ethische goedkeuringen voorafgaand aan het verzamelen van monsters volgens de voorschriften van de lokale autoriteiten. Over het algemeen levert 1 ml vers bloed 1 miljoen PBMC’s op en CD14+ monocyten zijn goed voor ongeveer 10% -30% van de PBMC’s. Ter vergelijking: 10 ml van een leukocytenkegel kan 5 x 10 8-15 x 108 PBMC’s bevatten. Voor meer informatie over PBMC-isolatie raadpleegt u een eerder protocol37. 2. Isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) uit volbloed Verzamel het vereiste volume vers bloed van gezonde donoren in lithium-heparine-verzamelbuizen.OPMERKING: Andere opvangbuizen met geschikte anticoagulantia kunnen ook worden gebruikt (bijv. natriumheparinebuizen). Voor hogere celtellingen kunnen leukocytenkegels of buffy coats worden gebruikt. Om de PBMC’s te isoleren, brengt u het bloed over in een nieuwe buis van 50 ml en verdunt u het met steriele 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) in een verhouding van 1: 1 of 1: 3 voor respectievelijk vers bloed of leukocytenkegels / buffy-jassen. Meng de cellen voorzichtig meerdere keren door inversie. Bereid buizen van 15 ml met 3 ml dichtheidsgradiëntmedium. Leg langzaam 8-10 ml verdund bloed op de bovenkant van het dichtheidsgradiëntmedium en centrifugeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) op 400 x g zonder rem.OPMERKING: Breng het bloed voorzichtig aan op het dichtheidsgradiëntmedium om vermenging te voorkomen. Mengen kan leiden tot het verlies van PBMC’s. Gooi de bovenste laag (die het plasma bevat) voorzichtig weg met een Pasteur-pipet, verzamel de onderliggende interfaselaag met de PBMC’s (witte, ringachtige structuur) en breng deze laag over in een nieuwe buis van 50 ml. Suspensie de cellen met steriele 1x PBS tot 50 ml en spoel het restdichtheidsgradiëntmedium af door gedurende 10 minuten bij RT met volle rem op 300 x g te centrifugeren. Om resterende bloedplaatjes te verwijderen, herhaalt u het proces met een extra langzamere spin bij 200 x g gedurende 10 minuten bij RT zonder rem. Optioneel: Om de overdracht van rode bloedcellen te verwijderen, verdunt u de rode bloedcellysisbuffer (10x, materiaaltabel) 1:10 in gedestilleerd water en brengt u 3 ml van de verdunde buffer aan op de pellet. Meng en incubeer gedurende 3 minuten. Was de pellet in maximaal 50 ml 1x PBS en centrifugeer op 300 x g gedurende 10 minuten bij RT met volle rem. Resuspendeer de geïsoleerde en gezuiverde PBMC’s in 20 ml 1x PBS en tel ze met behulp van een hemacytometer of volgens andere standaardmethoden.OPMERKING: De methoden voor celverdunning en celtelling moeten dienovereenkomstig worden aangepast op basis van de gebruikte celdichtheid en telinrichting. 3. Verrijking van CD14+ monocyten uit PBMC’s Isoleer CD14+ monocyten uit de PBMC’s met een menselijke CD14+ selectiekit volgens het protocol van de fabrikant (Materiaaltabel).OPMERKING: Klassieke CD14+CD16− monocyten zijn de belangrijkste bron van OC-voorlopers35; alternatieve zuiveringsmethoden kunnen worden overwogen. Breng 1 x 107 PBMC’s over in een geschikte polystyreen buis met ronde bodem (d.w.z. die past op de magneet van de selectiekit) en pellet de cellen gedurende 5 minuten op 300 x g . Gooi het supernatant weg, resuspendien de celpellet in de celscheidingsbuffer (PBS, 2% foetaal runderserum [FBS], 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur [EDTA]) tot een eindconcentratie van 1 x 108 cellen/ml en incubeer gedurende 10 minuten met 10 μl antilichaamcocktail per 100 μl.OPMERKING: De cellen worden geresuspendeerd bij 1 x 108 cellen / ml; Pas de volumes dienovereenkomstig aan. Voeg na incubatie 10 μL van de magnetische nanodeeltjesparels per 100 μL toe en incubeer gedurende 3 minuten met het deksel erop.OPMERKING: Pas de volumes van de antilichaamcocktail en magnetische kralen aan om een concentratie van 10 μL/ml te verkrijgen. Vul het volume aan tot 2,5 ml met de celscheidingsbuffer, plaats de buis in een magneet (zonder deksel) en incubeer gedurende 3 minuten. Gooi de negatieve celpopulatie weg door één continue beweging door inversie terwijl de buis nog in de magneet zit.OPMERKING: Als u >2 x 108 PBMC’s en een grotere magneet gebruikt, vult u tot 5 ml of 10 ml met celscheidingsbuffer volgens de instructies van de fabrikant. Verwijder de buis van de magneet en was de verrijkte CD14+ monocyten die aan de magnetische kralen zijn bevestigd door ze opnieuw te suspenderen in 2,5 ml van de celscheidingsbuffer. Incubeer gedurende 3 minuten in de magneet zoals voorheen, gooi de negatieve fractie weg en herhaal dit nog een keer. Centrifugeer alle verzamelde cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g , gooi het supernatant weg en resuspensie van de cellen in 5 ml minimaal essentieel alfamedium (α-MEM; Materiaalopgave) aangevuld met 1% L-glutamine, 1% penicilline/streptomycine (complete α-MEM) en 10% FBS.OPMERKING: Een controle van de zuiverheid na verrijking via flowcytometrie wordt aanbevolen en er moet een zuiverheid van ≥96% worden verwacht. Extra wasstappen (stap 3.6) kunnen de zuiverheid verhogen. 4. Oc-differentiatie in vitro Tel de verrijkte CD14+ monocyten met behulp van een hemacytometer. Pellet de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten en resuspensie bij 1 x 106 cellen/ml in volledige α-MEM aangevuld met 10% FBS. Om de OC’s te differentiëren, voegt u M-CSF in een eindconcentratie van 25 ng / ml toe aan de celsuspensie.OPMERKING: Voeg voor 1 ml celsuspensie 0,25 μL M-CSF toe uit een stamconcentratie van 100 μg/ml. Meng door grondig te pipetteren om de celsuspensie en plaat 100 μL/put in een vlakke bodem 96-well plaat te homogeniseren tot een uiteindelijke celdichtheid van 1 x 105 cellen/put. Voeg 200 μL/put steriel gedestilleerd water toe aan de putten rond de vergulde cellen om mediumverdamping en randeffecten in het kweeksysteem te voorkomen. Incubeer de cellen ‘s nachts, gedurende ongeveer 18-20 uur, bij 37 °C met 5% CO2. Verwijder na een nacht incubatie voorzichtig de helft van het medium (50 μL / put) door aspiratie met behulp van een P200-pipet, vermijd het aanraken van de bodem van de put en vervang door verse warme complete α-MEM met 10% FBS, 25 ng / mL M-CSF en 50 ng / ml RANKL voor een eindconcentratie van 25 ng / mlOPMERKING: Voeg voor 1 ml medium 0,25 μl M-CSF en 0,5 μl RANKL toe vanaf een stamconcentratie van 100 μg/ml. Verander de media om de 3 dagen en differentieer de cellen in OC’s gedurende 7-14 dagen (figuur 1).OPMERKING: Houd de M-CSF- en RANKL-concentraties consistent in de hele cultuur. Figuur 1: OC-differentiatieworkflow. Schematisch overzicht van CD14+ monocytenisolatie van PBMC’s en differentiatie in volwassen OC’s in aanwezigheid van M-CSF en RANKL gedurende 7-14 dagen. RT = kamertemperatuur. Afbeelding gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 5. TRAP kleuring voor osteoclasten Verwijder voorzichtig het medium, fixeer de gedifferentieerde adherente OC’s met 100 μL / put van de eerder bereide fixatieve oplossing en incubeer gedurende 1 min. Raak de bodem van de putjes niet aan om krassen op de aanhangende cellen te voorkomen.OPMERKING: De fixatieve oplossing wordt als volgt bereid: 12,5 ml citraatoplossing (inbegrepen in de TRAP-kleuringskit), 32,5 ml aceton en 5 ml 37% formaldehyde. Was de putjes drie keer met 300 μL steriel gedestilleerd water. Tik de borden droog na het wassen. Bereid een kleuringsoplossing volgens de instructies van de fabrikant (materiaaltabel); voeg 5 μL Fast Garnet en 5 μL natriumnitriet toe om de Fast Garnet-oplossing te maken; meng door inversie en incubeer gedurende 3 minuten bij RT. Bereid 1 ml kleuringsoplossing door 900 μL steriel gedestilleerd water, 10 μL naftol, 40 μL acetaatoplossing, 50 μL tartraatoplossing en 10 μL Fast Garnet-oplossing te mengen. Voeg 100 μL/put vers bereide kleuringsoplossing toe en incubeer de plaat in het donker gedurende 20 minuten bij 37 °C. Verwijder na incubatie de kleuringsoplossing door inversie en was de plaat drie keer met 300 μL / put gedestilleerd water. Verwijder het overtollige water door op de borden op keukenpapier te tikken. Laat de platen open en beschermd tegen het licht om een nacht aan de lucht te drogen.OPMERKING: Droge platen kunnen maximaal 6 maanden worden bewaard. Soms kunnen restbuffers de ontwikkeling van schimmel bevorderen, die zichtbaar is onder de microscoop; Dit kan op elk moment worden verwijderd door de aangetaste putten met gedestilleerd water te wassen en ze opnieuw aan de lucht te laten drogen. Maak foto’s met 10x of 20x met behulp van een brightfield-microscoop met een tegeloptie om het hele putoppervlak vast te leggen. Tel handmatig de OC’s die zijn geïdentificeerd als TRAP + paars gekleurde cellen met meer dan drie kernen met behulp van een beeldanalysesoftware met een celtellerplug-in.OPMERKING: Het aantal TRAP + OC’s per put is donorafhankelijk en kan variëren van ~ 200-1.600 OC’s / put, met een gemiddelde van ongeveer 1.000 OC’s / put. Bovendien, om de gegevens te analyseren, moeten de OC-nummers worden bepaald in drie verschillende putten (technische replicaties) en moet het gemiddelde worden berekend voor elke aandoening en voor elke biologische replicatie. 6. Botresorptietest Plaats de vers verrijkte CD14+ monocyten op 96-well osteo-assay platen bedekt met calciumfosfaat op 1 x 105 cellen/put, en differentieer de OC’s gedurende 7-14 dagen, zoals aangegeven in stap 4.1-4.8, en verander het medium om de 3 dagen.OPMERKING: Dentine/ivoor of rundercorticale botplakken kunnen worden gebruikt in plaats van osteo-assayplaten. Als dat zo is, moet de totale tijd van de cultuur worden verlengd tot 14-21 dagen vanwege het complexere substraat dat moet worden geresorbeerd. Verwijder op het eindtijdpunt voorzichtig het medium, vermijd het aanraken van de bodem van de put en lyseer de cellen met 10% natriumhypochlorietoplossing. Was de putjes drie keer met gedestilleerd water. Scan de droge platen met een brightfieldmicroscoop en analyseer/kwantificeer de verkregen beelden van de resorptieputten met behulp van beeldanalysesoftware. 7. Actine ring fluorescerende kleuring Plaat 100 μL/put van de geïsoleerde CD14+ monocyten in een 18-well kamer schuif bij een celdichtheid van 1 x 105 cellen/put. Onderscheid de OC’s in aanwezigheid van M-CSF en RANKL zoals eerder beschreven (stappen 4.1-4.8), inclusief het om de 3 dagen vervangen van het medium. Verwijder op het eindtijdpunt voorzichtig het medium en was elke put twee keer met 200 μL / put voorverwarmde PBS, pH 7,4. Laat de putten niet drogen tussen een van de stappen. Bevestig het monster met 100 μL/put van 4% formaldehyde-oplossing in PBS en incubeer gedurende 10 minuten bij RT op een orbitale shaker met zacht schudden.OPMERKING: Methanol kan actine verstoren tijdens het fixatieproces. Daarom is het het beste om methanolhoudende fixeermiddelen te vermijden. Het voorkeursfixatief is methanolvrij formaldehyde. De orbitale schudder die in deze stap van het protocol werd gebruikt, was ingesteld op een vermogensinstelling van 3 uit 10. Was tweemaal met 200 μL/put PBS, permeabiliseer de cellen met 100 μL/well van 0,1% Triton X-100 oplossing verdund in PBS, en incubeer gedurende 10 minuten bij RT op een orbitale shaker met zacht schudden. Was tweemaal met 200 μL/put PBS. Om niet-specifieke binding te blokkeren en het signaal te verhogen, voegt u 100 μL/put blokkeeroplossing gemaakt met 2% runderserumalbumine (BSA)/PBS-oplossing toe. Incubeer gedurende 20 minuten bij RT op een orbitale shaker met zacht schudden. Verwijder de blokkerende oplossing en voeg 100 μL/put fluorescerend geconjugeerde falloïdine-oplossing verdund in 2% BSA/PBS-oplossing toe. Incubeer gedurende 20 minuten bij RT op een orbitale shaker met zacht schudden en beschermd tegen licht.OPMERKING: Pas de concentratie van de falloïdinekleurstof aan volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Was tweemaal met 200 μL/put PBS, kleurt de kernen met 100 μL/put van een oplossing van PBS die 300 nM DAPI bevat en incubeer gedurende 10-15 minuten bij RT op een orbitale schudder met zacht schudden en beschermd tegen licht.OPMERKING: DAPI wordt verdund in gedestilleerd water om een DAPI-stamoplossing van 14,3 mM (5 mg/ml) te maken. De stamoplossing wordt verder verdund tot de uiteindelijke concentratie van 300 μM. Ten slotte wordt de DAPI-oplossing van 300 μM nog een keer verdund in PBS tot een eindconcentratie van 300 nM. Verwijder na 10-15 minuten de DAPI-oplossing en vervang deze door 100 μL/well PBS.OPMERKING: Afhankelijk van de gekozen kamerdia’s, kunt u deze opslaan met een geschikt volume PBS (100 μL/put voor 18-puts kamerdia’s), of de dia monteren met afdekplaten en een geschikt montagemedium. De kamerglaasjes kunnen tot 1 week in de koelkast bewaard worden. Gebruik voor kamerglaasjes met 18 putten een kleuringsvolume van 50-100 μL en 200-300 μL voor het wassen. Schaal dienovereenkomstig op voor de andere schuifformaten van de kamer. Om verdamping te voorkomen, bewaart u de afdekstroken in een afgedekte container tijdens de incubatietijden. Het gebruik van een orbitale shaker wordt aanbevolen, maar is niet essentieel. Visualiseer de kleuring met behulp van geschikte immunofluorescentie of confocale microscopen en vergrotingen tussen 4x en 40x. 8. Verrijking van volwassen OC’s en OC-precursoren via flowcytometriesortering Resuspendeer de vers verrijkte CD14+ monocyten bij 1 x 106 cellen/ml en differentieer ze in volwassen OC’s in aanwezigheid van M-CSF en RANKL op dezelfde manier als hierboven beschreven (stappen 4.1-4.8).OPMERKING: Bij het opschalen van een plaat met 96 putten naar een grotere plaatgrootte, volgt u tabel 1; deze volumes worden berekend uitgaande van een 1 x 106 cellen/ml oplossing en bieden een optimale dichtheid voor cel-celfusie. Was op dag 7 de putjes eenmaal met warme PBS en voeg 50 μL toe aan 1 ml (volume bepaald door de gebruikte plaatgrootte) accutase. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 20 min. Controleer na de incubatie de platen onder een lichtmicroscoop om te zien of de cellen zijn losgekomen. Maak verder de cellen los door de platen aan alle kanten aan te tikken en ze op en neer te pipetteren. Verzamel de celsuspensie in een conische buis van 15 ml. Was de putjes met warme PBS (geen Ca 2+, geen Mg2+) en combineer ze met de celsuspensie. Herhaal stap 8.2-8.3 een of twee keer totdat de meeste cellen zijn losgemaakt.OPMERKING: Accutase, de aanbevolen methode voorafgaand aan oppervlaktekleuring voor flowcytometrische analyse, maakt geen zeer grote OC’s los. Het herstelpercentage is ~50%-70%. Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten, resuspensie van de celpellet in 1 ml PBS en tel de cellen met trypanblauwe uitsluiting. Resuspendeer de cellen bij 1 x 106 cellen/ml, verwijder 100 μL overeenkomend met 1 x 105 cellen en breng die cellen over in een nieuwe polypropyleen reageerbuis. Voeg 200 μL van de celsorteerbuffer toe en zet dit opzij op ijs als de ongekleurde controle. Kleuring de rest van de cellen met levende/dode kleurstof verdund op 1:750 gedurende 10 minuten bij RT en beschermd tegen licht.OPMERKING: Live/dead kleuring moet worden uitgevoerd in afwezigheid van FBS om hoge achtergrondkleuring te voorkomen. Vul de opvangbuis van 15 ml met de levende/dode gekleurde celsuspensie aan met warme celsorteerbuffer (1x PBS, geen Ca 2+, geen Mg2+, 1% FBS en 5 mM EDTA) en centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g om de cellen te pelleteren.OPMERKING: Een hoge concentratie EDTA en een lage concentratie FBS worden aanbevolen in de sorteerbuffer om celklonten te voorkomen. Verwijder een volume dat overeenkomt met 1 x 105 cellen en breng ze over in een nieuwe polypropyleen reageerbuis voor de OSCAR-isotyperegeling. Breng alle resterende cellen over in een andere polypropyleen reageerbuis voor kleuring en celsortering.OPMERKING: Polypropyleen reageerbuizen worden gebruikt voor het sorteren omdat de cellen minder snel aan deze buizen hechten dan aan polystyreenbuizen. Draai de buizen op 400 x g gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren en gooi het overtollige supernatant weg door inversie. Resuspendie van de celkorrel in een antilichaammastermixoplossing bereid volgens tabel 2. Bevlek de OSCAR-isotypecontrolebuis met CD14-antilichaam en OSCAR-isotypecontrole in plaats van het OSCAR-antilichaam. Incubeer de cellen bij 4 °C beschermd tegen het licht gedurende 30 minuten. Was de cellen na 30 minuten door vijf volumes van de celsorteerbuffer toe te voegen en centrifugeer gedurende 5 minuten op 400 x g bij 4 °C. Resuspendeer de cellen in 300-1.000 μL koude celsorteerbuffer en verkrijg de cellen met behulp van een flowcytometriesorteermachine uitgerust met een 100μM mondstuk.OPMERKING: OC’s zijn zeer kleverige cellen, dus het is belangrijk om ze door een steriel membraan van 70 μm te filteren voordat ze worden gesorteerd. Gate de OC’s en pre-OC’s als CD14−OSCAR+. Stel de OSCAR+ poort in op basis van de OSCAR isotype besturingsbuis. Verzamel de gesorteerde cellen in polypropyleen reageerbuizen met volledige α-MEM aangevuld met 20% FBS bij 8 °C. Na het sorteren, pellet de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT, tel de cellen en resuspensie voor downstream-toepassingen.OPMERKING: Meestal, om ~ 1 x 105 gesorteerde pre-OC’s / OC’s te krijgen, begint u met ~ 10 x 106 cellen verguld op dag 0. De lage herstelsnelheid wordt beïnvloed door celverlies tijdens het losmaken met accutase en door de verwerking voor kleuring en sortering. Het wordt aanbevolen om de hele procedure uit te voeren met steriele buffers en reagentia en onder steriele omstandigheden te werken. 9. ATP-test voor mitochondriale activiteit Incubeer de verrijkte CD14+ monocyten in aanwezigheid van M-CSF en RANKL in een 96-well plaat op dezelfde manier als eerder beschreven (stappen 4.1-4.8). Plaat vier extra voorwaarden in drievoud te gebruiken als controles. Voer de ATP-test uit met de luminescentie ATP-detectietestkit volgens de handleiding van de fabrikant. Kortom, om de ATP-oplossing te bereiden, voegt u 10 ml van de substraatbufferoplossing toe aan het gelyofiliseerde substraat en laat u het gedurende 30 minuten bij RT incuberen.OPMERKING: Verschillende methoden kunnen worden gebruikt om de intracellulaire ATP-productie te meten. Hierin hebben we de detectie van ATP-productie door luminescentie gebruikt. Bereid tijdens de incubatie de controles als volgt voor en voeg deze rechtstreeks toe aan de controleputten: 2-Deoxy-D-glucose (2DG) bij 10 mM en 100 mM, oligomycine bij 1 μM en 100 mM 2DG in combinatie met 1 μM oligomycine. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C met 5% CO2.OPMERKING: De 2DG blokkeert glycolyse, terwijl oligomycine een remmer is van oxidatieve fosforylering. Het combineren van deze twee remmers resulteert in het volledige verlies van ATP-productie via glycolyse en oxidatieve fosforylering, wat betekent dat ze dienen als een interne controle voor de ATP-test. Voeg voor 10 mM en 100 mM 2DG-regelaars respectievelijk 0,5 μL en 5 μL 2M 2DG-stamoplossing per 100 μL-cultuurput toe. Verdun voor 1 μM oligomycine de 5 mM stamoplossing 1:100 in medium en voeg 2 μL/put toe aan de speciale controleputten. Voeg voor de laatste controle 5 μL 2DG en 2 μL verdunde oligomycine-oplossing per put toe. Voeg 50 μL van de ATP-oplossing toe aan elke put om de reactie te stoppen en incubeer bij RT op een shaker bij 700 tpm gedurende 5-10 minuten beschermd tegen licht. Breng 100 μL van het supernatant over op een 96-well white-bottom plaat specifiek voor de ATP-test en lees de plaat af met behulp van een luminescentielezer.