عزل الخلايا التائية القائمة على التعويم وتنشيطها وتوسيعها من عينات خلايا الدم أحادية النواة المحيطية البشرية باستخدام الفقاعات الدقيقة
Summary
الهدف من هذه الدراسة هو إثبات جدوى الفصل القائم على التعويم لعزل وتنشيط وتوسيع الخلايا التائية البشرية الأولية.
Abstract
تعد عملية عزل الخلايا التائية من خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) لإنشاء مزارع خارج الجسم الحي أمرا بالغ الأهمية للبحث والاختبارات السريرية والعلاجات القائمة على الخلايا. في هذه الدراسة ، يتم تقديم بروتوكول بسيط وجديد لعزل وتنشيط وتوسيع الخلايا التائية من PBMCs خارج الجسم الحي . تستخدم هذه الدراسة تقنية فرز الخلايا المنشطة بالطفو الوظيفي (BACS) لعزل الخلايا التائية وتنشيطها. باختصار ، يتضمن البروتوكول الاختيار الإيجابي لخلايا CD3 + من PBMCs المشتقة من leukopak ، يليها تحفيز مشترك لمدة 48 ساعة مع فقاعات streptavidin الدقيقة (SAMBs) المترافقة مسبقا المضادة ل CD28 قبل النقل في 24 لوحة بئر. توفر الفقاعات الدقيقة الوظيفية فرصة فريدة لتنشيط الخلايا بشكل مزدهر ، مما يؤدي إلى أنماط ظاهرية تكاثرية تسمح بالتوسع بأقل قدر من الإرهاق. توفر هذه التقنية استنفادا أقل لأن الفقاعات الدقيقة المحفزة المشتركة تظل طافية وتعود إلى الجزء العلوي من وسط الاستزراع ، مما يقلل من مقدار الوقت الذي تتلامس فيه الخلايا المتوسعة مع عوامل التحفيز المشترك. تشير النتائج إلى أن الخلايا التائية المعزولة والمستزرعة تتلقى تحفيزا كافيا للتنشيط والتكاثر ولكن ليس إلى الحد الذي يؤدي إلى فرط النشاط ، مما يؤدي بعد ذلك إلى الإرهاق ، كما يتضح من وجود PD-1 المفرط.
Introduction
يتم حاليا إجراء أكثر من 500 تجربة سريرية للعلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) في جميع أنحاء العالم ، وتتوفر أربعة منتجات للعلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية (CAR-T) في السوق1. ومع ذلك ، لا تزال هناك العديد من احتياجات البحث والتصنيع في الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية والتي يجب معالجتها لتحسين الفعالية وقابلية التوسع والنجاح طويل الأجل لهذه العلاجات العلاجية المحتملة2،3،4،5. يبدأ البحث السريري والتصنيع بالتبني للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية بعزل الخلايا التائية من عينة دم محيطية والتحفيز اللاحق ونقل وتوسيع الخلايا المعزولة. تتطلب المعلمات مثل استعادة الخلايا التائية والنقاء وإشارات التنشيط / الاستنفاد دراسة متأنية عند اختيار تقنيات عزل الخلايا وتحفيزها لأبحاث الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهميةوتصنيعها 3،4،6. الأهم من ذلك ، هناك حاجة إلى تحسين الثبات العلاجي لعلاجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية عن طريق تقليل العوائق البيولوجية الناتجة عن عمليات التصنيع الحالية ، مثل استنفاد الخلايا التائية ، لتعزيز الفعالية العلاجية 6,7.
كبديل لطرق عزل الخلايا التقليدية مثل فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) وفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS) ، هنا ، يتم عرض فرز الخلايا المنشط بالطفو (BACS) باستخدام الفقاعات الدقيقة لعزل الخلايا التائية. يستخدم فصل الفقاعات الدقيقة كريات مجهرية مجوفة (فقاعات دقيقة) لربط الأهداف وتعويمها على سطح عينات السوائل 8,9. من خلال تشغيل الفقاعات الدقيقة مع الأجسام المضادة (أي مضادات CD3) ، يمكن اختيار مجموعات الخلايا التائية المرغوبة بشكل إيجابي من عينات الدم المحيطية. بعد ذلك ، تم توضيح استخدام مجموعة مختلفة من الفقاعات الدقيقة التي تعمل بالأجسام المضادة (أي anti-CD28) للمشاركة في تحفيز وتنشيط الخلايا التائية المختارة إيجابيا في هذا العمل. توفر الفقاعات الدقيقة سير عمل عزل وتنشيط بسيط وقابل للضبط للغاية يولد خلايا تائية جاهزة لزراعة الخلايا العالقة والتطبيقات النهائية مثل التعديل الوراثي والتوسع. بشكل حاسم ، يعزز تنشيط الخلايا الطافية مع الفقاعات الدقيقة تحفيز الخلايا المقيدة لمنع استنفاد الخلايا التائية المفرط7.
بالنسبة لهذه الدراسة ، كان قياس التدفق الخلوي هو الأداة الأساسية المستخدمة لتحليل العزلة والتنشيط ونجاح النقل للفقاعات الدقيقة الوظيفية ، بالإضافة إلى توفير معلومات مفصلة حول المجموعات السكانية الفرعية المحددة الموجودة خلال مراحل النمو والتوسع بعد النقل. بالإضافة إلى قياس التدفق الخلوي ، تم استخدام المجهر الساطع والفلوري لتأكيد صحة الخلية ، والتشكل ، ونجاح النقل. بناء على هذه النتائج ، توفر تقنية وبروتوكول الفقاعات الدقيقة بديلا أكثر قابلية للضبط والألطف لطرق العزل والتنشيط التقليدية المستخدمة حاليا اليوم. على وجه الخصوص ، تظهر الخلايا التي يتم تنشيطها بالفقاعات الدقيقة تعبيرا أقل بشكل ملحوظ عن علامات استنفاد الخلايا التائية مقارنة بتلك التي يتم ملاحظتها عادة باستخدام الأدوات والمجموعات المتوافقة مع معايير الصناعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح البروتوكول الموصوف بعزل الخلايا التائية من عينات PBMC وتنشيط الخلايا التائية العالقة في وسائط المزرعة ذات الفقاعات الدقيقة. تعتمد هذه الطريقة على الفقاعات الدقيقة الوظيفية التي يوفر طفوها المتأصل فرصة فريدة لإدخال إشارات التحفيز المشترك إلى الخلايا وتنشيطها أثناء تعليقها في وسط است…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates | VWR | 76081-560 | |
| Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody | Biolegend | 302904 | |
| Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| Normal Human PBMCs | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated | Innovative Research | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) | Akadeum | 11110-000 |
References
- Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
- Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
- Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223 (2019).
- Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
- Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
- Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832 (2020).
- Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580 (2017).
- Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , (2022).
- McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , (2018).
- Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93 (2020).
- Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
- Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104 (2010).
