Konjugering medierer horisontal genoverføring ved å mobilisere plasmid-DNA over to forskjellige celler, noe som letter spredningen av gunstige gener. Dette arbeidet beskriver en mye brukt metode for effektiv påvisning av konjugativ plasmidoverføring, basert på bruk av differensialmarkører i konjugativ plasmid, donor og mottaker for å oppdage transkonjugering.
Konjugering representerer en av hovedmekanismene som muliggjør horisontal genoverføring i gramnegative bakterier. Dette arbeidet beskriver metoder for studier av mobilisering av naturlig forekommende konjugative plasmider, ved hjelp av to naturlig forekommende plasmider som et eksempel. Disse protokollene er avhengige av differensiell tilstedeværelse av valgbare markører i donor, mottaker og konjugativ plasmid. Spesielt inkluderer de beskrevne metodene 1) identifisering av naturlige konjugative plasmider, 2) kvantifisering av konjugasjonshastigheter i fast kultur, og 3) diagnostisk påvisning av antibiotikaresistensgener og plasmidreplicontyper hos transkonjugante mottakere ved polymerasekjedereaksjon (PCR). Protokollene beskrevet her er utviklet i sammenheng med å studere evolusjonær økologi av horisontal genoverføring, for å skjerme for tilstedeværelse av konjugative plasmider som bærer antibiotikaresistensgener i bakterier som finnes i miljøet. Den effektive overføringen av konjugative plasmider observert i disse forsøkene i kultur fremhever den biologiske relevansen av konjugering som en mekanisme som fremmer horisontal genoverføring generelt og spredning av antibiotikaresistens spesielt.
I 1946 beskrev Lederberg og Tatum1 en seksuell prosess i Escherichia coli K-12 som nå er kjent som konjugering. Bakteriell konjugering er prosessen der en bakteriecelle (donoren) overfører ensrettet genetisk materiale til en annen celle (mottakeren) ved direkte celle-til-celle-kontakt. Konjugering er bredt fordelt i bakterier2,3, selv om fraksjonen av donorceller som uttrykker konjugasjonsmaskineriet vanligvis er svært liten4.
Plasmider er autonomt replikerende ekstrakromosomale DNA-elementer. I tillegg til gener som er involvert i plasmidreplikasjon og vedlikehold, bærer plasmider ofte en last med gener som er involvert i tilpasning til miljøutfordringer, for eksempel tungmetaller eller eksponering for antibiotika5. Konjugative plasmider er en klasse av plasmider med et sett spesialiserte gener som tillater overføring til mottakerceller og støtter deres utholdenhet etter overføringen6. Konjugative plasmider varierer i størrelse fra 21,8 kb til 1,35 Mb i bakterier i phylum Pseudomonadota (synonymt med proteobakterier), med medianen rundt 100 kb 5,7. De har også generelt et lavt kopinummer, muligens for å holde den metabolske byrden på verten lav 8,9.
Det typiske konjugative apparatet består av fire komponenter: en overføringsopprinnelse (oriT), en relaxase, et type IV-koblingsprotein og et type IV-sekresjonssystem (en rørlignende struktur kalt pilus som gjør det mulig for givere å kontakte mottakere)6. Bare en svært liten brøkdel av cellene som bærer konjugative plasmider uttrykker konjugasjonsmaskineriet4, men hvis plasmidene gir en kondisjonsfordel, kan transkonjugantene raskt ekspandere i populasjonen. Mellom 35% og over 80% av E. coli-isolater samlet fra forskjellige habitater har konjugative plasmider med gener som gir resistens mot minst ett antibiotika10,11; Derfor er horisontal genoverføring mediert av konjugative plasmider en viktig mekanisme som driver den globale spredningen av antibiotikaresistensgener12.
Parringseksperimenter utført i laboratoriekultur har vist at konjugasjonsfrekvensen påvirkes av flere faktorer, inkludert mottakercellens natur, vekstfase, celletetthet, donor-til-mottaker-forhold, om konjugering utføres i flytende eller faste medier, karbon, oksygen, gallsalter, metallkonsentrasjoner, tilstedeværelse av pattedyrceller, temperatur, pH og parringstid13,14, 15.
Dette arbeidet beskriver protokoller for å oppdage tilstedeværelsen av konjugative plasmider i en gitt vertsstamme, for å kvantifisere konjugasjonshastighetene i fast kultur, og for å dobbeltsjekke overføringen til mottakerceller. Disse protokollene kan brukes som et første skritt for identifisering av naturlige konjugative plasmider egnet for forskning. De bruker et minimum antall forenklede trinn fordi de er utformet for å skjerme tilstedeværelsen av konjugative plasmider i bakterier oppnådd fra flere kilder (miljømessige, kommersielle og patogene) i skala (dusinvis til hundrevis av givere).
I tillegg vises tester for å oppdage om mobiliseringen av et gitt konjugativ plasmid er uavhengig av antibiotika som brukes til deteksjon (dvs. relevansen av antibiotikaresistensgenet under seleksjon) og for å sammenligne konjugasjonsratene for to konjugative plasmider funnet i forskjellige miljøisolater.
Basert på den genetiske sammensetningen av de relevante konjugative plasmidene (plasmid replicon og antibiotikaresistensgensammensetning), kan hvert trinn i protokollen modifiseres for å studere virkningen av en rekke faktorer som sannsynligvis vil påvirke konjugasjonshastigheten.
Generell eksperimentell design:
De essensielle komponentene som trengs for å sette opp et parringseksperiment er donorceller, en mottakerstamme og faste medier for å velge givere (antibiotika A), mottakere (antibiotika B) og transkonjuganter (antibiotika A og B). Transkonjuganter er mottakerceller som stabilt opprettholder donorens konjugative plasmid.
Donorceller er resistente mot antibiotika (antibiotikum A) og er følsomme for markøren eller markørene som brukes til å velge mottakerceller (antibiotika B). Den genomiske plasseringen av antibiotikaresistensgenet (dvs. om det er lokalisert i kromosomet eller et plasmid av donorcellen) trenger ikke å være kjent a priori, fordi mobilisering av antibiotikaresistensmarkører til mottakeren (etter en direkte donor-mottakerkontakt) innebærer at de donorleverte markørene var i et plasmid.
En mottakerstamme (kjent for å ta konjugative plasmider) må ha en stabil valgbar markør som ikke er tilstede i donoren; Denne valgbare markøren er generelt resistent mot et antibiotika eller biocid som ligger i kromosomet. Valget av mottakeren som skal brukes i parringsforsøk er kritisk, fordi noen E. coli-stammer varierer i deres evne til å ta konjugative plasmider16.
Når disse komponentene er etablert, er enhver koloni som vokser på medier med begge antibiotika (A og B) etter en donor-mottakerparkontakt, en antatt transkonjugant (figur 1). Dette forutsetter at donorer kan vokse i medier med antibiotika A, men ikke kan vokse i medier med antibiotika B, og at mottakere er i stand til å vokse i media med antibiotika B, men ikke i stand til å vokse med antibiotika A. Transkonjugering kan bekreftes ved hjelp av to diagnostiske tester. Den første testen består av deteksjon (ved polymerasekjedereaksjon [PCR] amplifisering av gener eller andre metoder) av gener funnet i det konjugative plasmidet i transkonjugante kolonier. Den andre testen innebærer bruk av differensialkolonifargemarkører basert på laktosemetabolisme. Differensialkolonifargen avsløres ved bruk av MacConkey-agar; Laktosen i agar kan brukes som gjæringskilde av laktosefermenterende (LAC+) mikroorganismer. Disse mikroorganismene produserer organiske syrer, spesielt melkesyre, som senker pH. Nøytral rød er en pH-indikator inkludert i mediet som går fra off-white til lys rød / rosa når pH faller under 6,817. Dermed produserer E. coli laktose-positive stammer større rosa kolonier på MacConkey agar, mens laktose-negative stammer produserer blekgule og mindre kolonier på MacConkey agar.
Figur 1: Eksperimentell design brukt for å påvise tilstedeværelse av konjugative plasmider i donorstammer. I dette eksemplet bærer giveren et konjugativ plasmid med et antibiotikaresistensgen som gir resistens mot antibiotika A, men de er utsatt for antibiotika B. Omvendt har mottakeren en kromosomresistensdeterminant som gir beskyttelse mot antibiotika B, men det er mottakelig for antibiotika A. Transkonjuganter er resistente mot begge antibiotika (A og B), fordi de har det konjugative plasmidet til donoren som gir resistens mot antibiotika A og kromosomet til mottakeren som gir beskyttelse mot antibiotika B. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Konjugasjonsraten for et donor-mottakerpar (under gitte eksperimentelle forhold) kan beregnes ved å dele antall transkonjuganter med antall givere eller med antall mottakere; Den første satsen indikerer brøkdelen av donorceller som viser funksjonelt uttrykk for konjugasjonsmaskineriet av donoren16,18, mens den andre satsen indikerer mottakerens evne til å ta konjugative plasmider 19,20. I denne studien, med mindre annet er oppgitt, representerer konjugasjonsraten brøkdelen av mottakerceller som blir transkonjugante (dvs. rate per mottaker).
Her rapporteres to uavhengige parringsforsøk, som involverer en E. coli-mottaker og to E. coli-donorer. I tillegg ble forskjellige antibiotika brukt til å velge transkonjuganter for en av donorene for å bekrefte at et enkelt multiresistent plasmid kan velges med noen av antibiotikaresistensgenene som finnes i det konjugative plasmidet.
Donor- og mottakerstammene som brukes i dette arbeidet har blitt fullstendig sekvensert for å forstå alle komponenter i dette eksperimentelle systemet; Imidlertid ble disse protokollene designet for å skjerme for tilstedeværelse av konjugative plasmider i verter av ukjent sekvens, og kan også brukes i denne eksperimentelle konteksten; Men i dette tilfellet sekvenseres de relevante genene først.
Donor- og mottakerstammene som brukes i protokollen er følgende:
Giver 1. E. coli SW4955 ble samlet inn i en innsjø i Baton Rouge (LA, USA). Den har et 134 797 bp konjugativ plasmid (p134797) med IncFIC (FII) og IncFIB (AP001918) svar. Dette konjugative plasmidet har gener som gir resistens mot tredjegenerasjons kefalosporiner (CTX-M-55), aminoglykosider (aac(3)-IIa og aadA1), fenikol (catA2), tetrasykliner (tet(A)), trimetoprim (dfrA14) og sulfonamider (sul3). For et fullstendig kart over p134797, se figur 2A. E. coli SW4955 er laktosepositiv, og produserer rosa kolonier på MacConkey agar.
Giver 2. E. coli SW7037 ble samlet inn i Lake Erie (Ottawa County, OH, USA). Den bærer et 101 718 bp konjugativ plasmid (p101718) med et IncI1-I (Alpha) svar. Dette konjugative plasmidet har et gen som gir resistens mot betalaktamer (blaCMY-2). For et fullstendig kart over p101718, se figur 2B. E. coli SW7037 er også laktosepositiv, og produserer rosa kolonier på MacConkey-agar.
Figur 2: Genetisk kart over de konjugative plasmidene som er brukt i denne studien. (A) Plasmid p134797, det konjugative plasmidet funnet i E. coli-stamme SW4955. (B) Plasmid p101718, det konjugative plasmidet funnet i E. coli-stamme SW7037. Antibiotikaresistensgener er markert i blått, og gener som tilhører det konjugative apparatet er markert i rødt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Mottaker. E. coli LMB100 brukes som mottaker. Dette er en plasmidløs stamme som er motstandsdyktig mot rifampicin (100 mg / L) og streptomycin (100 mg / L). Å ha resistens mot to antibiotika reduserer muligheten for resistensmutasjoner som oppstår i donoren som vil forstyrre tolkningen av resultatene. I tillegg er E. coli LMB100 laktosenegativ, og kan skilles fra de to donorstammene fordi den produserer blekgule og små kolonier (i motsetning til større, rosa kolonier) på MacConkey agar.
Når donoren er laktosenegativ, anbefaler vi å bruke en laktosepositiv mottaker (f.eks. E. coli J53). LMB100- og J53-stammene er tilgjengelige for andre laboratorier for bruk. Send en forespørsel til Dr. Gerardo Cortés-Cortés sammen med en adresse og FedEx-nummer.
Det solide mediet som trengs for å velge og telle givere, mottakere og transkonjuganter, er MacConkey-agar i petriskåler 100 mm i diameter. Tilsetning av følgende antibiotika er nødvendig: (i) Media A: karbenicillin (100 mg / L) for å telle givere og for å sikre at mottakerne ikke kan vokse med dette antibiotika. (ii) Media B: rifampicin (100 mg / L) + streptomycin (100 mg / L) for å telle mottakere og for å sikre at givere ikke kan vokse i disse to antibiotika. (iii) Media AB: karbenicillin (100 mg/L) + rifampicin (100 mg/L) + streptomycin (100 mg/L) for å oppnå og telle transkonjuganter. (iv) Medium C: ingen antibiotika til å strippe alle isolater som er studert.
Konjugasjonsratene for konjugative plasmider fra E. coli SW4955 og E. coli SW7037 til E. coli LMB100 sammenlignes. I tillegg, når det gjelder p134797 konjugativ plasmid (SW4955-stammen), erstattes antibiotikumet karbenicillin (100 mg / L) med gentamicin (2 mg / L), kloramfenikol (25 mg / L), tetracyklin (10 mg / L), trimetoprim (20 mg / L) eller sulfametoksazol (100 mg / L) i påfølgende eksperimenter for å fastslå om antibiotikaresistensmarkøren som brukes til utvelgelse, har noen innvirkning på resultatene.
Konjugative plasmider gir tilgang til en felles pool av gener innenfor en bestemt miljøsetting gjennom rekombinasjon og horisontal genoverføring34. Dermed er konjugative plasmider evolusjonære enheter som er i stand til å anskaffe og tildele funksjoner som tillater bakterier å tilpasse seg flere forhold (inkludert resistens mot antibiotika, resistens mot metaller, oppkjøp av metaller, biofilmdannelse og patogene gener, blant andre) innen en tidsmessig skala av timer.
Dette arbeidet presenterer en protokoll for identifisering av konjugative plasmider i bakterier. For at protokollen skal fungere, må markørene som brukes skille mellom donor- og mottakerstammer, som vist av kontrollene i media A og B. De må også effektivt velge celler som bærer plasmidet. Parringsreaksjonen er kritisk. I denne reaksjonen må givere og mottakere ta langvarig kontakt (gjennom pili) for at konjugering skal skje. Alt som kan forstyrre celle-til-celle-kontakt, for eksempel utilstrekkelig inkubasjonstid eller risting eller omrøring av kulturen, reduserer dermed effektiviteten av konjugering. Valg av mottaker er også kritisk, da noen mottakerstammer er motstandsdyktige mot bøyning35,36. LMB100 er foreslått som mottaker av valg, da det er i stand til å ta plasmider av flere inkompatibilitetstyper.
Konjugasjonshastigheten er spesifikk for hvert plasmiddonorkromosompar, mottaker og miljøtilstand. Konjugeringen av spesifikke plasmider har vist seg å være følsom for et stort antall variabler, inkludert vekstfase, celletetthet, donor-til-mottaker-forhold, om konjugering utføres i flytende eller faste medier, karbon, oksygen, gallesalter, metallkonsentrasjoner, tilstedeværelse av pattedyrceller, temperatur, pH og parringstid13,14,15 . Studien av disse interaksjonene avhenger av den første påvisningen av et konjugativ plasmid som skal studeres i dybden. Dermed kan protokollen beskrevet her også modifiseres for å utforske virkningen av forskjellige eksperimentelle variabler, selv om dette kommer på bekostning av å begrense antall screenede givere. Det kan også identifisere mobiliserbare plasmider i verter som har hjelperplasmider (dvs. plasmider som muliggjør konjugering ved å gi funksjoner som mangler fra de mobiliserbare plasmidene i trans6).
Å vite sekvensen av det konjugative plasmidet anbefales (men ikke nødvendig for å oppdage konjugering, som diskutert ovenfor). Når donorene er laktosenegative (produserer gule kolonier på MacConkey agar), kan en laktosepositiv mottaker (som produserer rosa kolonier på MacConkey agar) brukes til å skille ekte transkonjuganter fra donorceller som er i stand til å vokse på media for å velge transkonjuganter. Protokollen beskrevet her er designet for å oppdage konjugative plasmider fra miljømessige, kommersielle og patogene medlemmer av familien Enterobacteriaceae; Den kan imidlertid brukes med alle bakteriearter med egnet donor, mottaker, antibiotika (er) og fargemarkører. Identifiseringen av disse kritiske komponentene i andre bakterier krever systematiske studier ved bruk av flere givere, mottakere og markører (antibiotika og farger). Denne protokollen er ikke testet i grampositive bakterier.
Flere varianter av metoden presentert her er rapportert i litteraturen, nylig gjennomgått20. Det kvalitative utfallet kan også refereres til på forskjellige måter (f.eks. ekskonjugant frekvens og genoverføringsfrekvens), og dimensjonsløse enheter kan brukes til å rapportere konjugasjonseffektivitet (ml/CFU x h)20.
Protokollen beskrevet her løser flere begrensninger som tidligere ikke var adressert av eksisterende metoder:16,18,19,20. Først er det identifisert en egnet mottaker. For det andre minimerer bruken av to antibiotika (rifampicin og streptomycin) for å velge ekte transkonjuganter muligheten for at donorer utvikler resistens mot en av antibiotika som brukes til å velge transkonjuganter gjennom spontan mutagenese. Falske transkonjuganter kan også skyldes tilskuerbeskyttelse ved hydrolyse av antibiotika som brukes til å velge transkonjuganter av enzymer (f.eks. beta-laktamaser) produsert i store mengder av giveren. For det tredje er flere eksperimentelle kontroller inkludert for å sikre at parringsproduktet er en ekte transkonjugant (dvs. en mottakercelle som stabilt har innlemmet donorens konjugative plasmid). Her presenterte vi to uavhengige metoder for å teste autentisiteten til transkonjugantene, nemlig en kolorimetrisk markør i MacConkey agar, og PCR-påvisning av replikonene og antibiotikaresistensgenene til det konjugative plasmidet hos mottakeren. Protokollen beskrevet her er også designet for å isolere og karakterisere konjugative plasmider fra miljømessige, kommersielle og patogene medlemmer av familien Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella og andre arter).
For å forstå konjugasjonsmekanikken har eksperimentelle observasjoner blitt modellert ved hjelp av datasimuleringer. Disse prediktive modellene estimerer frekvensen av plasmidoverføring for gitte veksttettheter av donorer, mottakere og transkonjuganter. En modell kjent som endepunktsmodellen fant terskler over hvilken hastigheten av plasmidoverføring i væskekultur, og konkluderte med at overføringshastigheten er upåvirket av celletetthet, donor: mottakerforhold og parringstid19. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) har blitt brukt som en alternativ metode for transkonjugant plasmiddeteksjon. FISH tillater plasmidvisualisering ved hjelp av fluorescensmikroskopi gjennom hybridisering av en DNA-sonde og et mål-DNA. Dermed tillater FISH visuell deteksjon av plasmidstrømmer over forskjellige cellepopulasjoner37, selv om den ikke har samme følsomhetsnivå som metoden som presenteres her hvis transkonjuganter oppdages ved visuell screening i motsetning til seleksjon.
Det er et enormt behov for å forstå biologien til konjugative plasmider som sprer antibiotikaresistensgener gjennom forskjellige komponenter i økosystemet (klinikk, landbruk, kloakk, dyreliv, husdyr, jord, elver og innsjøer). I sum letter de forenklede eksperimentelle betingelsene som presenteres i protokollene beskrevet her, screening av donorer i stor skala, og representerer dermed et sentralt verktøy for studiet av horisontal genoverføring med opprinnelse i konjugative plasmider fra en rekke kilder. De kan brukes til å undersøke forekomsten av antibiotikaresistensgener eller andre klinisk relevante gener i konjugative plasmider fra flere kilder og bakterier. De kan også tilpasses for studier av konjugering in vivo (f.eks. i tarmen til virveldyr) og for å studere forholdene som modulerer effektiviteten av konjugering. Alle disse studiene vil i stor grad bidra til å forstå hvordan mobilisering av multiresistente konjugative plasmider bidrar til spredning av multiresistens.
The authors have nothing to disclose.
LM-B, IMG, AT og IS ble støttet av NIH grant GM055246 tildelt LM-B. GC-C ble tildelt UC MEXUS-CONACYT Postdoctoral Fellowship to år på rad: AY 2017-18 og 2018-19. Vi takker studentene Sage Chavez og Pepper St. Clair fra Genentech-Foundation sponset Academic Inspiration Network (GAIN) mentorprogram for deres tekniske støtte i eksperimenter.
1.5 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 22-313630 | It can be replaced for another brand |
2.0 mL Cryogenic vials | Corning | 430659 | It can be replaced for another brand |
14 mL conical tubes | FALCON | 149597 | It can be replaced for another brand |
14 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 8850 | It can be replaced for another brand |
1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N0552G | |
250 mL sterile flasks | PYREX | 5320 | It can be replaced for another permanent marker brand |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38SI-212 | It can be replaced for another brand |
Agarose (molecular biology grade, multipurpose) | Fisher Scientific | BP160-500 | It can be replaced for another brand |
Carbenicillin | GOLD BIOTECHNOLOGY | C-103-50 | It can be replaced for another brand |
Disposable inoculating loops: 1 µL | Fisherbrand | 22-363-595 | It can be replaced for another brand |
DNA gel loading dye 6x | New England Biolabs | B7024S | It can be replaced for another brand |
EDTA | Fisher Scientific | BP119-500 | It can be replaced for another brand |
Electronic digital scale | Denver Instrument | APX-2001 | It can be replaced for another brand |
Eppendorf conical tubes: 1.5 mL | Eppendorf | 14-282-302 | It can be replaced for another brand |
Equipment for agarose gel electrophoresis | Fisher Scientific | FP300 | It can be replaced for another brand |
Ethanol-resistant markers | Sharpie | 37001; 37002; 37003 | It can be replaced for another brand |
Gel documentation systems (UVP GelSolo) | Analytakjena | SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01 | It can be replaced for another brand |
Gloves | X-GEN | 44-100M | Any nitrile gloves brand works |
Ice bucket | Thermo Fisher Scientific | 432128 | It can be replaced for another brand |
MacConkey agar | BD DIFCO | 212123 | |
Master Mix | BioLabs | M0496S | It can be replaced for another brand |
Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | It can be replaced for another brand |
Microcentrifuge tubes: 2.0 mL | Fisherbrand | 05-408-138 | It can be replaced for another brand |
Mueller Hinton agar | BD DIFCO | DF0479-17-3 | |
Mueller Hinton broth | BD DIFCO | 275730 | |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL | 740588. 250 | |
PCR tube racks | AXYGEN | R96PCRFSP | It can be replaced for another brand |
PCR tubes (0.2 mL) | AXYGEN | PCR-02-C | It can be replaced for another brand |
Rifampicin | Fisher Scientific | 50-164-7517 | |
Set of micropipettes that dispense between 1 – 10 μL (P10), 2–20 μL (P20), 20–200 μL (P200) and 200–1000 μL (P1000) | RAININ | 17008648; 17008650; 17008652; 17008653 | Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-3 | It can be replaced for another brand |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | 335905P | It can be replaced for another brand |
Sterilized tips for 10 μL, 200 μL and 1000 μL | Eclipse | 1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9 | It can be replaced for another brand |
Streptomycin | Fisher Scientific | BP910-50 | |
SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
Taq DNA Polymerase | BioLabs | M0273S | |
Thermal cycler C1000 Touch | Bio-Rad | 1851196 | It can be replaced for another brand |
Tris | Fisher Scientific | BP153-500 | It can be replaced for another brand |