Konjugering medierer horisontal genoverførsel ved at mobilisere plasmid-DNA på tværs af to forskellige celler, hvilket letter spredningen af gavnlige gener. Dette arbejde beskriver en udbredt metode til effektiv påvisning af konjugativ plasmidoverførsel, baseret på brugen af differentielle markører i det konjugative plasmid, donor og recipient til påvisning af transkonjugering.
Konjugering repræsenterer en af de vigtigste mekanismer, der letter horisontal genoverførsel i gramnegative bakterier. Dette arbejde beskriver metoder til undersøgelse af mobilisering af naturligt forekommende konjugative plasmider ved hjælp af to naturligt forekommende plasmider som et eksempel. Disse protokoller er afhængige af den differentielle tilstedeværelse af valgbare markører i donor, modtager og konjugativt plasmid. Specifikt omfatter de beskrevne metoder 1) identifikation af naturlige konjugative plasmider, 2) kvantificering af konjugeringshastigheder i fast kultur og 3) diagnostisk påvisning af antibiotikaresistensgener og plasmidreplikontyper i transkonjugante recipienter ved polymerasekædereaktion (PCR). De her beskrevne protokoller er udviklet i forbindelse med studiet af den evolutionære økologi ved horisontal genoverførsel for at screene for tilstedeværelsen af konjugative plasmider, der bærer antibiotikaresistensgener i bakterier, der findes i miljøet. Den effektive overførsel af konjugative plasmider observeret i disse eksperimenter i kultur fremhæver den biologiske relevans af konjugering som en mekanisme, der fremmer horisontal genoverførsel generelt og spredning af antibiotikaresistens i særdeleshed.
I 1946 beskrev Lederberg og Tatum1 en seksuel proces i Escherichia coli K-12, der nu er kendt som konjugering. Bakteriel konjugering er den proces, hvorved en bakteriecelle (donoren) overfører ensrettet genetisk materiale til en anden celle (modtageren) ved direkte celle-til-celle-kontakt. Konjugering er bredt fordelt i bakterier2,3, selvom fraktionen af donorceller, der udtrykker konjugeringsmaskineriet, typisk er meget lille4.
Plasmider er autonomt-replikerende ekstrakromosomale DNA-elementer. Ud over gener, der er involveret i plasmidreplikation og vedligeholdelse, bærer plasmider ofte en last af gener, der er involveret i tilpasning til miljømæssige udfordringer, såsom tungmetaller eller eksponering for antibiotika5. Konjugative plasmider er en klasse af plasmider med et sæt specialiserede gener, der tillader deres overførsel til modtagerceller og understøtter deres persistens efter overførslen6. Konjugative plasmider varierer i størrelse fra 21,8 kb til 1,35 Mb i bakterier i rækken Pseudomonadota (synonymt med proteobakterier), med medianen omkring 100 kb 5,7. De har også generelt et lavt kopinummer, muligvis for at holde den metaboliske byrde på værten lav 8,9.
Det typiske konjugative apparat består af fire komponenter: en overførselsoprindelse (oriT), en relaxase, et type IV-koblingsprotein og et type IV-sekretionssystem (en rørlignende struktur kaldet pilus, der gør det muligt for donorer at kontakte modtagere)6. Kun en meget lille brøkdel af celler, der bærer konjugative plasmider, udtrykker konjugationsmaskineriet4, men hvis plasmiderne giver en fitnessfordel, kan transkonjuganterne hurtigt ekspandere i populationen. Mellem 35% og over 80% af E. coli-isolater indsamlet fra forskellige levesteder har konjugative plasmider med gener, der giver resistens over for mindst et antibiotikum10,11; Derfor er horisontal genoverførsel medieret af konjugative plasmider en vigtig mekanisme, der driver den globale spredning af antibiotikaresistensgener12.
Parringsforsøg udført i laboratoriekultur har vist, at konjugationsfrekvensen påvirkes af flere faktorer, herunder recipientcellernes art, vækstfase, celletæthed, donor-til-recipient-forhold, om konjugering udføres i flydende eller faste medier, kulstof, oxygen, galdesalte, metalkoncentrationer, tilstedeværelse af pattedyrceller, temperatur, pH og parringstid13,14, 15.
Dette arbejde beskriver protokoller til påvisning af tilstedeværelsen af konjugative plasmider i en given værtsstamme, til kvantificering af konjugationshastighederne i fast kultur og til dobbeltkontrol af deres overførsel til modtagerceller. Disse protokoller kan bruges som et første skridt til identifikation af naturlige konjugative plasmider, der er egnede til forskning. De bruger et minimum antal forenklede trin, fordi de er designet til at screene tilstedeværelsen af konjugative plasmider i bakterier opnået fra flere kilder (miljømæssige, kommensale og patogene) i skala (snesevis til hundreder af donorer).
Derudover vises test til påvisning af, om mobiliseringen af et givet konjugativt plasmid er uafhængigt af det antibiotikum, der anvendes til påvisning (dvs. relevansen af antibiotikaresistensgenet under udvælgelse) og til sammenligning af konjugeringshastighederne for to konjugative plasmider, der findes i forskellige miljøisolater.
Baseret på den genetiske sammensætning af de relevante konjugative plasmider (plasmidreplikon og antibiotikaresistensgensammensætning) kan hvert trin i protokollen modificeres for at studere virkningen af en række faktorer, der sandsynligvis vil påvirke konjugationshastigheden.
Generelt eksperimentelt design:
De væsentlige komponenter, der er nødvendige for at oprette et parringseksperiment, er donorceller, en modtagerstamme og faste medier til udvælgelse af donorer (antibiotikum A), modtagere (antibiotikum B) og transkonjuganter (antibiotikum A og B). Transkonjuganter er modtagerceller, der stabilt opretholder donorens konjugative plasmid.
Donorceller er resistente over for et antibiotikum (antibiotikum A) og er modtagelige for den eller de markører, der bruges til at vælge modtagerceller (antibiotikum B). Den genomiske placering af antibiotikaresistensgenet (dvs. om det er placeret i kromosomet eller et plasmid i donorcellen) behøver ikke at være kendt på forhånd, fordi mobilisering af antibiotikaresistensmarkører til modtageren (efter en direkte donor-modtagerkontakt) indebærer, at de donorleverede markører var i et plasmid.
En recipientstamme (kendt for at tage konjugative plasmider) skal have en stabil, valgbar markør, der ikke er til stede i donoren; Denne valgbare markør er generelt resistent over for et antibiotikum eller biocid placeret i kromosomet. Udvælgelsen af modtageren, der skal bruges i parringsforsøg, er kritisk, fordi nogle E. coli-stammer varierer i deres evne til at tage konjugative plasmider16.
Når disse komponenter er etableret, er enhver koloni, der vokser på medier med både antibiotika (A og B) efter en donor-modtagerparkontakt, en formodet transkonjugant (figur 1). Dette forudsætter, at donorer kan vokse i medier med antibiotikum A, men ikke kan vokse i medier med antibiotikum B, og at modtagere er i stand til at vokse i medier med antibiotikum B, men ikke i stand til at vokse med antibiotikum A. Transkonjugering kan bekræftes ved hjælp af to diagnostiske tests. Den første test består af påvisning (ved polymerasekædereaktion [PCR] amplifikation af gener eller andre metoder) af gener, der findes i det konjugative plasmid i transkonjugante kolonier. Den anden test involverer brugen af differentielle kolonifarvemarkører baseret på lactosemetabolisme. Den differentierede kolonifarve afsløres ved brug af MacConkey agar; Laktosen i agaren kan bruges som gæringskilde af laktosefermenterende (LAC +) mikroorganismer. Disse mikroorganismer producerer organiske syrer, især mælkesyre, som sænker pH-værdien. Neutral rød er en pH-indikator, der indgår i mediet, og som skifter fra offwhite til lys rød/pink, når pH-værdien falder til under 6,817. Således producerer E. coli lactose-positive stammer større lyserøde kolonier på MacConkey agar, mens laktosenegative stammer producerer lysegule og mindre kolonier på MacConkey agar.
Figur 1: Eksperimentelt design anvendt til at detektere tilstedeværelsen af konjugative plasmider i donorstammer. I dette eksempel bærer donoren et konjugativt plasmid med et antibiotikaresistensgen, der giver resistens over for antibiotikum A, men de er modtagelige for antibiotika B. Omvendt har modtageren en kromosomresistensdeterminant, der giver beskyttelse mod antibiotikum B, men den er modtagelig for antibiotikum A. Transkonjuganter er resistente over for begge antibiotika (A og B), fordi de har donorens konjugative plasmid, der giver resistens over for antibiotikum A og modtagerens kromosom, der giver beskyttelse mod antibiotika B. Klik her for at se en større version af denne figur.
Konjugationsraten for et donor-recipient-par (under givne forsøgsbetingelser) kan beregnes ved at dividere antallet af transkonjuganter med antallet af donorer eller med antallet af recipienter; Den første rate angiver den brøkdel af donorceller, der udviser funktionel ekspression af konjugationsmaskineriet af donoren16,18, mens den anden rate angiver modtagerens evne til at tage konjugative plasmider 19,20. I denne undersøgelse, medmindre andet er angivet, repræsenterer konjugeringshastigheden den brøkdel af modtagerceller, der bliver transkonjugerende (dvs. hastighed pr. Modtager).
Her rapporteres to uafhængige parringsforsøg med en E. coli-modtager og to E. coli-donorer. Derudover blev forskellige antibiotika brugt til at vælge transkonjuganter til en af donorerne for at bekræfte, at et enkelt multiresistent plasmid kan vælges med et hvilket som helst af de antibiotikaresistensgener, der findes i det konjugative plasmid.
De donor- og modtagerstammer, der anvendes i dette arbejde, er blevet fuldt sekventeret for at forstå alle komponenter i dette eksperimentelle system; Disse protokoller blev imidlertid designet til at screene for tilstedeværelsen af konjugative plasmider i værter med ukendt sekvens og kan også bruges i denne eksperimentelle sammenhæng; I dette tilfælde sekventeres de relevante gener imidlertid først.
De donor- og modtagerstammer, der anvendes i protokollen, er følgende:
Donor: 1. E. coli SW4955 blev indsamlet i en sø i Baton Rouge (LA, USA). Det har et konjugativt plasmid på 134,797 bp (p134797) med IncFIC (FII) og IncFIB (AP001918) replicons. Dette konjugative plasmid har gener, der giver resistens over for tredje generations cephalosporiner (blaCTX-M-55), aminoglycosider (aac (3) -IIa og aadA1), phenicols (catA2), tetracycliner (tet (A)), trimethoprim (dfrA14) og sulfonamider (sul3). For et komplet kort over p134797, se figur 2A. E. coli SW4955 er laktose-positiv, producerer lyserøde kolonier på MacConkey agar.
Donor: 2. E. coli SW7037 blev indsamlet i Lake Erie (Ottawa County, OH, USA). Det bærer et konjugativt plasmid på 101.718 bp (p101718) med et IncI1-I (Alpha) replicon. Dette konjugative plasmid har et gen, der giver resistens over for beta-lactamer (blaCMY-2). For et komplet kort over p101718, se figur 2B. E. coli SW7037 er også laktosepositiv og producerer lyserøde kolonier på MacConkey-agar.
Figur 2: Genetisk kort over de konjugative plasmider, der anvendes i denne undersøgelse . (A) Plasmid p134797, det konjugative plasmid, der findes i E. coli-stamme SW4955. (B) Plasmid p101718, det konjugative plasmid, der findes i E. coli stamme SW7037. Antibiotikaresistensgener er fremhævet med blåt, og gener, der tilhører det konjugative apparat, fremhæves med rødt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Modtager. E. coli LMB100 bruges som modtager. Dette er en plasmidfri stamme, der er resistent over for rifampin (100 mg / L) og streptomycin (100 mg / L). At have resistens over for to antibiotika reducerer muligheden for, at der opstår resistensmutationer i donoren, som ville forstyrre fortolkningen af resultaterne. Derudover er E. coli LMB100 laktosenegativ og kan skelnes fra de to donorstammer, fordi den producerer lysegule og små kolonier (i modsætning til større, lyserøde kolonier) på MacConkey-agar.
Når donoren er laktosenegativ, anbefaler vi at bruge en laktosepositiv modtager (f.eks. E. coli J53). LMB100- og J53-stammerne er tilgængelige for andre laboratorier til brug. Send en anmodning til Dr. Gerardo Cortés-Cortés sammen med en adresse og FedEx-nummer.
Det faste medie, der er nødvendigt for at vælge og tælle donorer, modtagere og transkonjuganter, er MacConkey-agar i petriskåle med en diameter på 100 mm. Der er behov for tilsætning af følgende antibiotika: (i) Medier A: carbenicillin (100 mg/l) for at tælle donorer og for at sikre, at modtagerne ikke kan vokse med dette antibiotikum. ii) Medier B: rifampin (100 mg/l) + streptomycin (100 mg/l) for at tælle recipienter og sikre, at donorer ikke kan vokse i disse to antibiotika. iii) Media AB: carbenicillin (100 mg/l) + rifampin (100 mg/l) + streptomycin (100 mg/l) til opnåelse og tælling af transkonjuganter. iv) Medier C: ingen antibiotika til at stribe alle undersøgte isolater.
Konjugationshastighederne for konjugative plasmider fra E. coli SW4955 og E. coli SW7037 til E. coli LMB100 sammenlignes. I tilfælde af p134797 konjugativt plasmid (SW4955-stammen) erstattes antibiotikacarbenicillin (100 mg / l) med gentamicin (2 mg / l), chloramphenicol (25 mg / l), tetracyclin (10 mg / l), trimethoprim (20 mg / l) eller sulfamethoxazol (100 mg / l) i efterfølgende forsøg for at fastslå, om antibiotikaresistensmarkøren, der anvendes til udvælgelse, har nogen indflydelse på resultaterne.
Konjugative plasmider giver adgang til en fælles pulje af gener inden for en bestemt miljøindstilling gennem rekombination og horisontal genoverførsel34. Konjugative plasmider er således evolutionære enheder, der er i stand til at erhverve og tildele funktioner, der gør det muligt for bakterier at tilpasse sig flere tilstande (herunder resistens over for antibiotika, resistens over for metaller, erhvervelse af metaller, biofilmdannelse og patogene gener, blandt andre) inden for en tidsmæssig skala på timer.
Dette arbejde præsenterer en protokol til identifikation af konjugative plasmider i bakterier. For at protokollen skal fungere, skal de anvendte markører differentiere donor- og modtagerstammer, som vist ved kontrollerne i medier A og B. De skal også effektivt vælge celler, der bærer plasmidet. Parringsreaktionen er kritisk. I denne reaktion skal donorer og modtagere tage langvarig kontakt (gennem pili) for at konjugering kan forekomme. Alt, hvad der kan forstyrre celle-til-celle-kontakt, såsom en utilstrækkelig inkubationstid eller omrystning eller omrøring af kulturen, reducerer således effektiviteten af konjugation. Valget af modtager er også kritisk, da nogle modtagerstammer er ildfaste over for konjugering35,36. LMB100 foreslås som den valgte modtager, da den er i stand til at tage plasmider af flere inkompatibilitetstyper.
Konjugationshastigheden er specifik for hvert plasmid-donorkromosompar, modtager og miljøtilstand. Konjugeringen af specifikke plasmider har vist sig at være følsom over for et stort antal variabler, herunder vækstfase, celletæthed, donor-til-modtager-forhold, om konjugering udføres i flydende eller faste medier, kulstof, ilt, galdesalte, metalkoncentrationer, tilstedeværelse af pattedyrceller, temperatur, pH og parringstid13,14,15 . Undersøgelsen af disse interaktioner afhænger af den indledende påvisning af et konjugativt plasmid, der skal undersøges i dybden. Således kan protokollen beskrevet her også ændres for at undersøge virkningen af forskellige eksperimentelle variabler, selvom dette kommer på bekostning af at begrænse antallet af screenede donorer. Det kan også identificere mobiliserbare plasmider i værter, der har hjælperplasmider (dvs. plasmider, der muliggør konjugering ved at tilvejebringe funktioner, der mangler fra de mobiliserbare plasmider i trans6).
Det anbefales at kende sekvensen af det konjugative plasmid (men ikke nødvendigt for at detektere konjugering som diskuteret ovenfor). Når donorerne er laktosenegative (producerer gule kolonier på MacConkey agar), kan en laktosepositiv modtager (der producerer lyserøde kolonier på MacConkey agar) bruges til at skelne ægte transkonjuganter fra donorceller, der er i stand til at vokse på medierne for at vælge transkonjuganter. Protokollen beskrevet her er designet til at detektere konjugative plasmider fra miljømæssige, kommensale og patogene medlemmer af familien Enterobacteriaceae; Det kan dog bruges med alle bakteriearter med en passende donor, modtager, antibiotika (er) og farvemarkører. Identifikation af disse kritiske komponenter i andre bakterier kræver systematiske undersøgelser ved hjælp af flere donorer, modtagere og markører (antibiotika og farver). Denne protokol er ikke testet i grampositive bakterier.
Flere varianter af den metode, der præsenteres her, er blevet rapporteret i litteraturen, for nylig gennemgået20. Det kvalitative resultat kan også refereres til på forskellige måder (f.eks. ekskonjugantfrekvens og genoverførselsfrekvens), og dimensionsløse enheder kan bruges til at rapportere konjugeringseffektivitet (ml/CFU x h)20.
Den her beskrevne protokol løser flere begrænsninger, der tidligere ikke blev behandlet ved hjælp af eksisterende metoder16,18,19,20. For det første er der fundet en egnet modtager. For det andet minimerer brugen af to antibiotika (rifampin og streptomycin) til udvælgelse af ægte transkonjuganter muligheden for, at donorer udvikler resistens over for et af de antibiotika, der bruges til at vælge transkonjuganter gennem spontan mutagenese. Falske transkonjuganter kan også skyldes beskyttelse af andre tilstedeværende ved hydrolyse af det antibiotikum, der anvendes til udvælgelse af transkonjuganter ved hjælp af enzymer (f.eks. beta-lactamaser), der produceres i store mængder af donoren. For det tredje er flere eksperimentelle kontroller inkluderet for at sikre, at produktet af parring er en ægte transkonjugant (dvs. en modtagercelle, der stabilt har inkorporeret donorens konjugative plasmid). Her præsenterede vi to uafhængige metoder til at teste transkonjuganternes autenticitet, nemlig en kolorimetrisk markør i MacConkey-agar og PCR-påvisning af replicons og antibiotikaresistensgener af det konjugative plasmid i modtageren. Protokollen beskrevet her er også designet til at isolere og karakterisere konjugative plasmider fra miljømæssige, kommensale og patogene medlemmer af familien Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella og andre arter).
For at forstå konjugationsmekanikken er eksperimentelle observationer blevet modelleret ved hjælp af computersimuleringer. Disse prædiktive modeller estimerer hyppigheden af plasmidoverførsel for givne væksttætheder hos donorer, modtagere og transkonjuganter. En model kendt som endepunktsmodellen fandt tærskler, over hvilke hastigheden af plasmidoverførsel i flydende kultur og konkluderede, at overførselshastigheden er upåvirket af celletæthed, donor-modtager-forhold og parringstid19. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er blevet anvendt som en alternativ metode til transkonjugant plasmiddetektion. FISH tillader plasmidvisualisering ved hjælp af fluorescensmikroskopi gennem hybridisering af en DNA-sonde og et mål-DNA. FISH tillader således visuel påvisning af plasmidstrømme på tværs af forskellige cellepopulationer37, selvom det ikke har samme følsomhedsniveau som den metode, der præsenteres her, hvis transkonjuganter detekteres ved visuel screening i modsætning til selektion.
Der er et enormt behov for at forstå biologien bag konjugative plasmider, der spreder antibiotikaresistensgener gennem forskellige komponenter i økosystemet (klinik, landbrug, spildevand, dyreliv, husdyr, jord, floder og søer). Alt i alt letter de forenklede eksperimentelle betingelser, der præsenteres i de her beskrevne protokoller, screening af donorer i stor skala og udgør således et nøgleværktøj til undersøgelse af horisontal genoverførsel med oprindelse i konjugative plasmider fra en række forskellige kilder. De kan bruges til at undersøge forekomsten af antibiotikaresistensgener eller andre klinisk relevante gener i konjugative plasmider fra flere kilder og bakterier. De kan også tilpasses til undersøgelse af konjugering in vivo (f.eks. i tarmen hos hvirveldyr) og til at studere de forhold, der modulerer effektiviteten af konjugering. Alle disse undersøgelser vil i høj grad bidrage til forståelsen af, hvordan mobiliseringen af multiresistente konjugative plasmider bidrager til spredningen af multiresistens.
The authors have nothing to disclose.
LM-B, IMG, AT og IS blev støttet af NIH-bevilling GM055246 tildelt LM-B. GC-C blev tildelt UC MEXUS-CONACYT Postdoctoral Fellowship i to på hinanden følgende år: AY 2017-18 og 2018-19. Vi takker eleverne Sage Chavez og Pepper St. Clair fra Genentech-Foundation sponsorerede Academic Inspiration Network (GAIN) mentorprogram for deres tekniske støtte i eksperimenter.
1.5 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 22-313630 | It can be replaced for another brand |
2.0 mL Cryogenic vials | Corning | 430659 | It can be replaced for another brand |
14 mL conical tubes | FALCON | 149597 | It can be replaced for another brand |
14 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 8850 | It can be replaced for another brand |
1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N0552G | |
250 mL sterile flasks | PYREX | 5320 | It can be replaced for another permanent marker brand |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38SI-212 | It can be replaced for another brand |
Agarose (molecular biology grade, multipurpose) | Fisher Scientific | BP160-500 | It can be replaced for another brand |
Carbenicillin | GOLD BIOTECHNOLOGY | C-103-50 | It can be replaced for another brand |
Disposable inoculating loops: 1 µL | Fisherbrand | 22-363-595 | It can be replaced for another brand |
DNA gel loading dye 6x | New England Biolabs | B7024S | It can be replaced for another brand |
EDTA | Fisher Scientific | BP119-500 | It can be replaced for another brand |
Electronic digital scale | Denver Instrument | APX-2001 | It can be replaced for another brand |
Eppendorf conical tubes: 1.5 mL | Eppendorf | 14-282-302 | It can be replaced for another brand |
Equipment for agarose gel electrophoresis | Fisher Scientific | FP300 | It can be replaced for another brand |
Ethanol-resistant markers | Sharpie | 37001; 37002; 37003 | It can be replaced for another brand |
Gel documentation systems (UVP GelSolo) | Analytakjena | SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01 | It can be replaced for another brand |
Gloves | X-GEN | 44-100M | Any nitrile gloves brand works |
Ice bucket | Thermo Fisher Scientific | 432128 | It can be replaced for another brand |
MacConkey agar | BD DIFCO | 212123 | |
Master Mix | BioLabs | M0496S | It can be replaced for another brand |
Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | It can be replaced for another brand |
Microcentrifuge tubes: 2.0 mL | Fisherbrand | 05-408-138 | It can be replaced for another brand |
Mueller Hinton agar | BD DIFCO | DF0479-17-3 | |
Mueller Hinton broth | BD DIFCO | 275730 | |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL | 740588. 250 | |
PCR tube racks | AXYGEN | R96PCRFSP | It can be replaced for another brand |
PCR tubes (0.2 mL) | AXYGEN | PCR-02-C | It can be replaced for another brand |
Rifampicin | Fisher Scientific | 50-164-7517 | |
Set of micropipettes that dispense between 1 – 10 μL (P10), 2–20 μL (P20), 20–200 μL (P200) and 200–1000 μL (P1000) | RAININ | 17008648; 17008650; 17008652; 17008653 | Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-3 | It can be replaced for another brand |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | 335905P | It can be replaced for another brand |
Sterilized tips for 10 μL, 200 μL and 1000 μL | Eclipse | 1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9 | It can be replaced for another brand |
Streptomycin | Fisher Scientific | BP910-50 | |
SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
Taq DNA Polymerase | BioLabs | M0273S | |
Thermal cycler C1000 Touch | Bio-Rad | 1851196 | It can be replaced for another brand |
Tris | Fisher Scientific | BP153-500 | It can be replaced for another brand |