コンジュゲーションは、プラスミドDNAを2つの異なる細胞に動員することにより、遺伝子の水平伝播を媒介し、有益な遺伝子の拡散を促進します。この研究では、接合プラスミド、ドナー、およびレシピエントの鑑別マーカーを使用してトランスコンジュゲーションを検出することに基づいて、接合プラスミド転移を効率的に検出するために広く使用されている方法について説明しています。
抱合は、グラム陰性菌の水平遺伝子導入を促進する主要なメカニズムの1つです。この研究では、2つの天然に存在するプラスミドを例として使用して、天然に存在する接合プラスミドの動員を研究する方法について説明します。これらのプロトコルは、ドナー、レシピエント、および接合プラスミドにおける選択可能なマーカーの異なる存在に依存しています。具体的には、記載される方法には、1)天然の接合プラスミドの同定、2)固体培養における抱合速度の定量、および3)ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるトランスコンジュガントレシピエントにおける抗生物質耐性遺伝子およびプラスミドレプリコンタイプの診断的検出が含まれる。ここで説明するプロトコルは、環境中に見られる細菌における抗生物質耐性遺伝子を運ぶ接合プラスミドの存在をスクリーニングするために、水平遺伝子導入の進化生態学を研究するという文脈で開発されました。培養におけるこれらの実験で観察された接合プラスミドの効率的な転写は、一般的な遺伝子水平伝播、特に抗生物質耐性の拡大を促進するメカニズムとしての接合の生物学的関連性を強調しています。
1946年、レーダーバーグとテイタム1は、現在抱合として知られている大腸菌K-12の性的プロセスについて説明しました。細菌結合は、細菌細胞(ドナー)が細胞間直接接触によって一方向に遺伝物質を別の細胞(レシピエント)に移すプロセスです。抱合は細菌2,3に広く分布しているが、接合機構を発現するドナー細胞の画分は通常非常に小さい4。
プラスミドは、自律複製する染色体外DNAエレメントです。プラスミドの複製と維持に関与する遺伝子に加えて、プラスミドは重金属や抗生物質への曝露などの環境問題への適応に関与する遺伝子の貨物を頻繁に運びます5。接合プラスミドは、レシピエント細胞への導入を可能にし、導入後の持続性をサポートする特殊な遺伝子のセットを持つプラスミドのクラスです6。接合プラスミドのサイズは、シュードモナドータ門(プロテオバクテリアと同義)の細菌で21.8 kbから1.35 Mbまで変化し、中央値は約100 kb 5,7です。それらはまた、おそらく宿主への代謝負荷を低く保つために、一般的に低いコピー数を有する8,9。
典型的な接合装置は、転移起点(oriT)、リラクターゼ、IV型結合タンパク質、IV型分泌系(ドナーがレシピエントと接触できるピルスと呼ばれる管状の構造)の4つの要素で構成されています6。接合プラスミドを保有する細胞のごく一部のみが接合機構を発現しますが4、プラスミドが適応度の利点を提供する場合、トランスコンジュガントは集団内で急速に拡大する可能性があります。異なる生息地から収集された大腸菌分離株の35%から80%以上は、少なくとも1つの抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を有する接合プラスミドを有する10,11;したがって、接合プラスミドによって媒介される水平遺伝子導入は、抗生物質耐性遺伝子の世界的な普及を推進する主要なメカニズムである12。
実験室培養で行われた交配実験は、接合頻度が、レシピエント細胞の性質、成長段階、細胞密度、ドナーとレシピエントの比率、コンジュゲーションが液体培地または固体培地のどちらで行われるか、炭素、酸素、胆汁酸塩、金属濃度、哺乳類細胞の存在、温度、pH、および交配時間を含む複数の要因によって影響を受けることを示しています13,14、15.
この研究では、特定の宿主株における接合プラスミドの存在を検出し、固体培養における接合速度を定量化し、レシピエント細胞へのそれらの移動を再確認するためのプロトコルについて説明します。これらのプロトコルは、研究に適した天然の接合プラスミドを同定するための最初のステップとして使用できます。それらは、複数の供給源(環境、共生、および病原性)から得られた細菌中の接合プラスミドの存在を大規模(数十から数百のドナー)でスクリーニングするように設計されているため、最小限の簡略化されたステップを使用します。
さらに、所与の接合プラスミドの動員が検出に使用された抗生物質とは無関係であるかどうか(すなわち、選択中の抗生物質耐性遺伝子の関連性)を検出し、異なる環境分離株で見出される2つの接合プラスミドの抱合率を比較するための試験が示されている。
関連する接合プラスミドの遺伝的構成(プラスミドレプリコンおよび抗生物質耐性遺伝子構成)に基づいて、プロトコルの各ステップを変更して、接合速度に影響を与える可能性のあるさまざまな要因の影響を研究することができます。
一般実験計画:
交配実験のセットアップに必要な必須成分は、ドナー細胞、レシピエント株、およびドナー(抗生物質A)、レシピエント(抗生物質B)、およびトランスコンジュガント(抗生物質AおよびB)を選択するための固体培地です。トランスコンジュガントは、ドナーの接合プラスミドを安定に維持するレシピエント細胞です。
ドナー細胞は抗生物質(抗生物質A)に耐性があり、レシピエント細胞(抗生物質B)を選択するために使用されるマーカーまたはマーカーに耐性があります。抗生物質耐性遺伝子のゲノム位置(すなわち、それが染色体に位置するか、ドナー細胞のプラスミドに位置するか)は、レシピエントへの抗生物質耐性マーカーの動員(ドナー−レシピエント間の直接接触後)がドナー提供マーカーがプラスミド中にあったことを意味するので、先験的に知る必要はない。
レシピエント株(接合プラスミドを取ることが知られている)は、ドナーに存在しない安定した選択マーカーを持っている必要があります。この選択可能なマーカーは、一般に、染色体に位置する抗生物質または殺生物剤に耐性がある。交配実験に使用するレシピエントの選択は、一部の 大腸菌 株が接合プラスミドを摂取する能力が異なるため、非常に重要です16。
これらの成分が確立されると、ドナーとレシピエントのペアが接触した後に抗生物質(AとB)の両方を含む培地上で増殖するコロニーは、推定トランスコンジュガントです(図1)。これは、ドナーが抗生物質Aを含む培地では増殖できるが抗生物質Bを含む培地では増殖できないこと、およびレシピエントが抗生物質Bを含む培地では増殖できるが、抗生物質Aでは増殖できないことを前提としています。最初のテストは、トランスコンジュガントコロニーの接合プラスミドに見られる遺伝子の検出(ポリメラーゼ連鎖反応[PCR]遺伝子の増幅、またはその他の方法による)で構成されます。2番目のテストでは、ラクトース代謝に基づく差動コロニーカラーマーカーを使用します。異なるコロニーの色は、マッコンキー寒天の使用によって明らかになります。寒天中の乳糖は、乳糖発酵(lac+)微生物による発酵源として使用できます。これらの微生物は、pHを下げる有機酸、特に乳酸を生成します。ニュートラルレッドは、pHが6.8を下回るとオフホワイトから明るい赤/ピンクに変わる培地に含まれるpHインジケーターです17。したがって、 大腸菌 ラクトース陽性株はマッコンキー寒天培地でより大きなピンク色のコロニーを生成しますが、ラクトース陰性株はマッコンキー寒天培地で淡黄色で小さなコロニーを生成します。
図1:ドナー株における接合プラスミドの存在を検出するために使用される実験デザイン。 この例では、ドナーは抗生物質Aに対する耐性を付与する抗生物質耐性遺伝子を有する接合プラスミドを有するが、抗生物質Bに感受性である。 逆に、レシピエントは抗生物質Bからの保護を与える染色体耐性決定基を有するが、抗生物質Aに感受性である。 トランスコンジュガントは抗生物質(AおよびB)の両方に耐性がある。 抗生物質Aに対する耐性を付与するドナーの接合プラスミドと、抗生物質Bからの保護を付与するレシピエントの染色体を持っているためです。 この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ドナーとレシピエントのペアの共役率は(所与の実験条件下で)トランスコンジュガントの数をドナーの数またはレシピエントの数で割ることによって計算できます。第1の速度は、ドナー16、18による接合機構の機能的発現を示すドナー細胞の画分を示し、一方、第2の速度は、接合プラスミド19、20を取るレシピエントの能力を示す。この研究では、特に明記しない限り、コンジュゲート速度は、トランスコンジュガントになるレシピエント細胞の割合(すなわち、レシピエント当たりの割合)を表す。
ここでは、1人の大腸菌レシピエントと2人の大腸菌ドナーを含む2つの独立した交配実験が報告されています。さらに、異なる抗生物質を使用してドナーの1人のトランスコンジュガントを選択し、接合プラスミドに見られる抗生物質耐性遺伝子のいずれかで単一の多剤耐性プラスミドを選択できることを確認しました。
この研究で使用されたドナー株とレシピエント株は、この実験システムのすべてのコンポーネントを理解するために完全に配列決定されています。ただし、これらのプロトコルは、未知の配列の宿主における接合プラスミドの存在をスクリーニングするように設計されており、この実験状況でも使用できます。ただし、この場合、関連する遺伝子が最初に配列決定されます。
プロトコルで使用されるドナー株とレシピエント株は次のとおりです。
ドナー1。 大腸菌 SW4955は、バトンルージュ(米国LA)の湖で収集されました。134,797 bp の接合プラスミド (p134797) と IncFIC(FII) および IncFIB (AP001918) のレプリコンがあります。この接合プラスミドは、第3世代セファロスポリン(blaCTX-M-55)、アミノグリコシド(aac(3)-IIa および aadA1)、フェニコール(catA2)、テトラサイクリン(tet(A))、トリメトプリム(dfrA14)、およびスルホンアミド(sul3)に対する耐性を付与する遺伝子を有する。p134797 の完全なマップについては、 図 2A を参照してください。 大腸菌 SW4955はラクトース陽性で、マッコンキー寒天培地にピンク色のコロニーを生成します。
ドナー2。 大腸菌 SW7037はエリー湖(米国オハイオ州オタワ郡)で採集された。101,718 bp の接合プラスミド (p101718) と IncI1-I(Alpha) レプリコンを担持しています。この接合プラスミドは、β-ラクタム(blaCMY-2)に対する耐性を付与する遺伝子を有する。p101718 の完全なマップについては、 図 2B を参照してください。 大腸菌 SW7037もラクトース陽性であり、マッコンキー寒天培地上にピンク色のコロニーを生成します。
図2:本研究で用いた接合プラスミドの遺伝子マップ 。 (a)プラスミドp134797、 大腸菌 株SW4955に見られる接合プラスミド。(b)プラスミドp101718、 大腸菌 SW7037株に見られる接合プラスミド。抗生物質耐性遺伝子は青色で強調表示され、接合装置に属する遺伝子は赤色で強調表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
受信者。 大腸菌 LMB100 が受信者として使用されます。これは、リファンピン(100 mg / L)およびストレプトマイシン(100 mg / L)に耐性のあるプラスミドレス株です。2つの抗生物質に耐性があると、結果の解釈を妨げる耐性変異がドナーに発生する可能性が低くなります。さらに、 大腸菌 LMB100は乳糖陰性であり、マッコンキー寒天培地上で淡黄色で小さなコロニー(大きなピンク色のコロニーとは対照的に)を生成するため、2つのドナー株と区別できます。
ドナーが乳糖陰性の場合、乳糖陽性レシピエント(例:大腸菌J53)の使用をお勧めします 。 LMB100およびJ53株は、他のラボで使用することができます。ヘラルド・コルテス・コルテス博士に住所とフェデックス番号を添えてリクエストを送信してください。
ドナー、レシピエント、およびトランスコンジュガントを選択してカウントするために必要な固体培地は、直径100 mmのペトリ皿に入ったマッコンキー寒天培地です。次の抗生物質の追加が必要です:(i)培地A:ドナーを数え、レシピエントがこの抗生物質で成長できないようにするためのカルベニシリン(100 mg / L)。(ii)培地B:リファンピン(100 mg / L)+ストレプトマイシン(100 mg / L)レシピエントを数え、ドナーがこれら2つの抗生物質で成長できないようにします。(iii)培地AB:カルベニシリン(100 mg / L)+リファンピン(100 mg / L)+ストレプトマイシン(100 mg / L)トランスコンジュガントを取得してカウントします。(iv)培地C:研究したすべての分離株にストリークする抗生物質はありません。
大腸菌SW4955および大腸菌SW7037から大腸菌LMB100への接合プラスミドの接合率を比較した。さらに、p134797 接合プラスミド (SW4955 株) の場合、抗生物質カルベニシリン (100 mg/L) をゲンタマイシン (2 mg/L)、クロラムフェニコール (25 mg/L)、テトラサイクリン (10 mg/L)、トリメトプリム (20 mg/L)、またはスルファメトキサゾール (100 mg/L) に置き換え、選択に使用した抗生物質耐性マーカーが結果に影響を与えるかどうかを確立します。
接合プラスミドは、組換えと水平遺伝子導入を通じて、特定の環境環境内の遺伝子の共同プールへのアクセスを提供します34。したがって、接合プラスミドは、細菌が時間的スケールで複数の条件(抗生物質に対する耐性、金属に対する耐性、金属の獲得、バイオフィルム形成、病原性遺伝子などを含む)に適応することを可能にする機能を獲得および付与できる進化的実体です。
この研究は、細菌中の接合プラスミドを同定するためのプロトコルを提示します。プロトコルが機能するためには、培地AおよびBのコントロールによって示されるように、使用されるマーカーがドナー株とレシピエント株を区別する必要があります。また、プラスミドを保有する細胞を効果的に選択する必要があります。嵌合反応は重要です。この反応では、ドナーとレシピエントは、抱合が起こるために(ピリを介して)長時間接触する必要があります。不十分なインキュベーション時間や培養物の振とうや攪拌など、細胞間の接触を妨げる可能性のあるものはすべて、結合の効率を低下させます。一部のレシピエント株は接合に難治性であるため、レシピエントの選択も重要です35,36。LMB100は、複数の非適合性タイプのプラスミドを採取できるため、最適なレシピエントとして提案されています。
結合率は、各プラスミド-ドナー染色体ペア、レシピエント、および環境条件に特異的です。特定のプラスミドのコンジュゲーションは、成長期、細胞密度、ドナーとレシピエントの比率、コンジュゲーションが液体培地で行われるか固体培地で行われるか、炭素、酸素、胆汁酸塩、金属濃度、哺乳類細胞の存在、温度、pH、交配時間など、多数の変数に敏感であることがわかっています13,14,15.これらの相互作用の研究は、詳細に研究される接合プラスミドの初期検出に依存します。したがって、ここで説明するプロトコルを変更して、さまざまな実験変数の影響を調べることもできますが、これにはスクリーニングされたドナーの数を制限するという犠牲が伴います。また、ヘルパープラスミド(すなわち、トランス6の動員可能なプラスミドに欠けている機能を提供することによって結合を可能にするプラスミド)を有する宿主中の動員可能なプラスミドを同定することもできる。
接合プラスミドの配列を知ることが推奨される(ただし、上記のように結合を検出するために必要ではない)。ドナーがラクトース陰性(MacConkey寒天培地上で黄色のコロニーを産生する)の場合、ラクトース陽性レシピエント(MacConkey寒天培地上でピンク色のコロニーを産生する)を使用して、真のトランスコンジュガントと、トランスコンジュガントを選択するために培地上で増殖できるドナー細胞を区別できます。ここで説明するプロトコルは、腸内細菌科の環境、共生、および病原性のメンバーからの接合プラスミドを検出するように設計されています。ただし、適切なドナー、レシピエント、抗生物質、およびカラーマーカーを持つ任意の細菌種で使用できます。他の細菌におけるこれらの重要な成分の同定には、複数のドナー、レシピエント、およびマーカー(抗生物質および色)を使用した系統的研究が必要です。このプロトコルは、グラム陽性菌ではテストされていません。.
ここに提示された方法のいくつかの変形が文献で報告されており、最近レビューされた20。定性的結果はさまざまな方法(例えば、エクスコンジュガント頻度および遺伝子導入頻度)で参照することもでき、無次元単位を使用してコンジュゲーション効率(mL/CFU x h)を報告することができる20。
ここで説明するプロトコルは、既存の方法16、18、19、20ではこれまで対処されていなかったいくつかの制限を解決する。まず、適切なレシピエントが特定されました。第二に、真のトランスコンジュガントを選択するために2つの抗生物質(リファンピンとストレプトマイシン)を使用することで、ドナーが自然突然変異誘発を通じてトランスコンジュガントを選択するために使用される抗生物質の1つに対する耐性を進化させる可能性が最小限に抑えられます。偽のトランスコンジュガントは、ドナーによって大量に産生される酵素(例えば、β-ラクタマーゼ)によるトランスコンジュガントを選択するために使用される抗生物質の加水分解による傍観者保護からも生じ得る。第三に、交配の産物が真のトランスコンジュガント(すなわち、ドナーの接合プラスミドを安定に取り込んだレシピエント細胞)であることを保証するために、いくつかの実験的対照が含まれる。ここでは、トランスコンジュガントの真正性をテストするための2つの独立した方法、すなわちMacConkey寒天培地の比色マーカーと、レシピエントの接合プラスミドのレプリコンと抗生物質耐性遺伝子のPCR検出を紹介しました。また、ここで説明するプロトコルは、腸内細菌科(エシェリヒア、クレブシエラ、エンテロバクター、シトロバクター、サルモネラ、赤痢菌、およびその他の種)の環境、共生、および病原性のメンバーから接合プラスミドを単離および特徴付けるように設計されています。
共役のメカニズムを理解するために、実験的観測はコンピュータシミュレーションを使用してモデル化されています。これらの予測モデルは、ドナー、レシピエント、およびトランスコンジュガントの特定の増殖密度に対するプラスミド導入の頻度を推定します。エンドポイントモデルとして知られるモデルは、液体培養におけるプラスミド転写速度がそれを超える閾値を発見し、転写速度は細胞密度、ドナー:レシピエント比、および交配時間の影響を受けないと結論付けました19。蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)は、トランスコンジュガントプラスミド検出の代替方法として使用されています。FISHは、DNAプローブとターゲットDNAのハイブリダイゼーションにより、蛍光顕微鏡を使用したプラスミドの可視化を可能にします。したがって、FISHは、異なる細胞集団37にわたるプラスミドフローの視覚的検出を可能にするが、トランスコンジュガントが選択とは対照的に視覚的スクリーニングによって検出される場合、ここに提示された方法と同じレベルの感度を有しない。
生態系のさまざまな構成要素(診療所、農業、下水、野生生物、家畜、土壌、河川、湖)を介して抗生物質耐性遺伝子を分散させている接合プラスミドの生物学を理解することが非常に必要です。要約すると、ここに記載されているプロトコルに示されている簡略化された実験条件は、大規模なドナーのスクリーニングを容易にし、したがって、さまざまなソースからの接合プラスミドに由来する水平遺伝子導入の研究のための重要なツールを表しています。これらは、複数の供給源および細菌からの接合プラスミドにおける抗生物質耐性遺伝子または他の臨床的に関連する遺伝子の有病率を調査するために使用できます。それらはまた、 in vivo (例えば、脊椎動物の腸内)での抱合の研究および接合の効率を調節する条件の研究に適応させることができる。これらの研究はすべて、多剤耐性接合プラスミドの動員が多剤耐性の拡大にどのように寄与するかを理解するのに大いに役立ちます。
The authors have nothing to disclose.
LM-B、IMG、AT、およびISは、LM-Bに授与されたNIH助成金GM055246によってサポートされました。GC-Cは、2017-18年度と2018-19年度の2年連続でUCメクサス-コナシットポスドクフェローシップを授与されました。ジェネンテック財団が後援するアカデミックインスピレーションネットワーク(GAIN)メンタリングプログラムの学生のセージチャベスとペッパーセントクレアに、実験の技術サポートに心から感謝します。
1.5 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 22-313630 | It can be replaced for another brand |
2.0 mL Cryogenic vials | Corning | 430659 | It can be replaced for another brand |
14 mL conical tubes | FALCON | 149597 | It can be replaced for another brand |
14 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 8850 | It can be replaced for another brand |
1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N0552G | |
250 mL sterile flasks | PYREX | 5320 | It can be replaced for another permanent marker brand |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38SI-212 | It can be replaced for another brand |
Agarose (molecular biology grade, multipurpose) | Fisher Scientific | BP160-500 | It can be replaced for another brand |
Carbenicillin | GOLD BIOTECHNOLOGY | C-103-50 | It can be replaced for another brand |
Disposable inoculating loops: 1 µL | Fisherbrand | 22-363-595 | It can be replaced for another brand |
DNA gel loading dye 6x | New England Biolabs | B7024S | It can be replaced for another brand |
EDTA | Fisher Scientific | BP119-500 | It can be replaced for another brand |
Electronic digital scale | Denver Instrument | APX-2001 | It can be replaced for another brand |
Eppendorf conical tubes: 1.5 mL | Eppendorf | 14-282-302 | It can be replaced for another brand |
Equipment for agarose gel electrophoresis | Fisher Scientific | FP300 | It can be replaced for another brand |
Ethanol-resistant markers | Sharpie | 37001; 37002; 37003 | It can be replaced for another brand |
Gel documentation systems (UVP GelSolo) | Analytakjena | SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01 | It can be replaced for another brand |
Gloves | X-GEN | 44-100M | Any nitrile gloves brand works |
Ice bucket | Thermo Fisher Scientific | 432128 | It can be replaced for another brand |
MacConkey agar | BD DIFCO | 212123 | |
Master Mix | BioLabs | M0496S | It can be replaced for another brand |
Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | It can be replaced for another brand |
Microcentrifuge tubes: 2.0 mL | Fisherbrand | 05-408-138 | It can be replaced for another brand |
Mueller Hinton agar | BD DIFCO | DF0479-17-3 | |
Mueller Hinton broth | BD DIFCO | 275730 | |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL | 740588. 250 | |
PCR tube racks | AXYGEN | R96PCRFSP | It can be replaced for another brand |
PCR tubes (0.2 mL) | AXYGEN | PCR-02-C | It can be replaced for another brand |
Rifampicin | Fisher Scientific | 50-164-7517 | |
Set of micropipettes that dispense between 1 – 10 μL (P10), 2–20 μL (P20), 20–200 μL (P200) and 200–1000 μL (P1000) | RAININ | 17008648; 17008650; 17008652; 17008653 | Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-3 | It can be replaced for another brand |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | 335905P | It can be replaced for another brand |
Sterilized tips for 10 μL, 200 μL and 1000 μL | Eclipse | 1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9 | It can be replaced for another brand |
Streptomycin | Fisher Scientific | BP910-50 | |
SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
Taq DNA Polymerase | BioLabs | M0273S | |
Thermal cycler C1000 Touch | Bio-Rad | 1851196 | It can be replaced for another brand |
Tris | Fisher Scientific | BP153-500 | It can be replaced for another brand |