संयुग्मन दो अलग-अलग कोशिकाओं में प्लास्मिड डीएनए को जुटाकर क्षैतिज जीन हस्तांतरण की मध्यस्थता करता है, जिससे लाभकारी जीन के प्रसार की सुविधा मिलती है। यह काम संयुग्मित प्लास्मिड ट्रांसफर का कुशल पता लगाने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि का वर्णन करता है, जो ट्रांसकोन्जेशन का पता लगाने के लिए वैवाहिक प्लास्मिड, दाता और प्राप्तकर्ता में अंतर मार्करों के उपयोग पर आधारित है।
संयुग्मन ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया में क्षैतिज जीन हस्तांतरण की सुविधा प्रदान करने वाले मुख्य तंत्रों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है। यह काम एक उदाहरण के रूप में दो स्वाभाविक रूप से पाए जाने वाले प्लास्मिड का उपयोग करके, स्वाभाविक रूप से होने वाले वैवाहिक प्लास्मिड के जुटाने के अध्ययन के तरीकों का वर्णन करता है। ये प्रोटोकॉल दाता, प्राप्तकर्ता और वैवाहिक प्लास्मिड में चयन योग्य मार्करों की अंतर उपस्थिति पर निर्भर करते हैं। विशेष रूप से, वर्णित विधियों में 1) प्राकृतिक वैवाहिक प्लास्मिड की पहचान, 2) ठोस संस्कृति में संयुग्मन दरों की मात्रा का परिमाणीकरण, और 3) पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा ट्रांसकोन्जुगेंट प्राप्तकर्ताओं में एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन और प्लास्मिड रिप्लिकॉन प्रकारों का नैदानिक पता लगाना शामिल है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल क्षैतिज जीन हस्तांतरण के विकासवादी पारिस्थितिकी का अध्ययन करने के संदर्भ में विकसित किए गए हैं, ताकि पर्यावरण में पाए जाने वाले बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक-प्रतिरोध जीन ले जाने वाले वैवाहिक प्लास्मिड की उपस्थिति की जांच की जा सके। संस्कृति में इन प्रयोगों में देखे गए वैवाहिक प्लास्मिड का कुशल हस्तांतरण सामान्य रूप से क्षैतिज जीन हस्तांतरण और विशेष रूप से एंटीबायोटिक प्रतिरोध के प्रसार को बढ़ावा देने वाले तंत्र के रूप में संयुग्मन की जैविक प्रासंगिकता पर प्रकाश डालता है।
1946 में, लेडरबर्ग और टैटम1 ने एस्चेरिचिया कोलाई के -12 में एक यौन प्रक्रिया का वर्णन किया जिसे अब संयुग्मन के रूप में जाना जाता है। बैक्टीरियल संयुग्मन वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा एक जीवाणु कोशिका (दाता) प्रत्यक्ष सेल-टू-सेल संपर्क द्वारा यूनिडायरेक्शनल आनुवंशिक सामग्री को दूसरे सेल (प्राप्तकर्ता) में स्थानांतरित करती है। संयुग्मन मोटे तौर पर बैक्टीरिया 2,3 में वितरित किया जाता है, हालांकि संयुग्मन मशीनरी को व्यक्त करने वाली दाता कोशिकाओं का अंश आमतौर पर बहुत छोटाहोता है।
प्लास्मिड स्वायत्त रूप से प्रतिकृति एक्स्ट्राक्रोमोसोमल डीएनए तत्व हैं। प्लास्मिड प्रतिकृति और रखरखाव में शामिल जीन के अलावा, प्लास्मिड अक्सर पर्यावरणीय चुनौतियों के अनुकूलन में शामिल जीन का एक कार्गो ले जाते हैं, जैसे कि भारी धातुएं या एंटीबायोटिक दवाओं के संपर्कमें 5. वैवाहिक प्लास्मिड विशेष जीन के एक सेट के साथ प्लास्मिड का एक वर्ग है जो प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को उनके हस्तांतरण की अनुमति देता है और स्थानांतरण 6 के बाद उनकी दृढ़ता का समर्थन करताहै। वैवाहिक प्लास्मिड फ़ाइलम स्यूडोमोनाडोटा (प्रोटीओबैक्टीरिया का पर्याय) में बैक्टीरिया में 21.8 केबी से 1.35 एमबी तक आकार में भिन्न होते हैं, जिसका औसत लगभग 100 केबी 5,7 होता है। उनके पास आम तौर पर कम कॉपी संख्या भी होती है, संभवतः मेजबान पर चयापचय बोझ को कम 8,9 रखने के लिए।
विशिष्ट वैवाहिक तंत्र में चार घटक होते हैं: स्थानांतरण की उत्पत्ति (ओरिट), एक रिलैक्सेज, एक प्रकार IV युग्मन प्रोटीन, और एक प्रकार IV स्राव प्रणाली (एक ट्यूब जैसी संरचना जिसे पिलस कहा जाता है जो दाताओं को प्राप्तकर्ताओं से संपर्क करने की अनुमति देता है)6. वैवाहिक प्लास्मिड ले जाने वाली कोशिकाओं का केवल एक बहुत छोटा अंश संयुग्मन मशीनरी4 को व्यक्त करता है, लेकिन अगर प्लास्मिड एक फिटनेस लाभ प्रदान करते हैं, तो ट्रांसकोनजुगेंट्स आबादी में तेजी से विस्तार कर सकते हैं। विभिन्न आवासों से एकत्र किए गए ई कोलाई आइसोलेट्स के 35% और 80% से अधिक के बीच जीन के साथ वैवाहिक प्लास्मिड होते हैं जो कम से कम एक एंटीबायोटिक10,11 के लिए प्रतिरोध प्रदान करते हैं; इसलिए, वैवाहिक प्लास्मिड द्वारा मध्यस्थ क्षैतिज जीन स्थानांतरण एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन12 के वैश्विक प्रसार को चलाने वाला एक प्रमुख तंत्र है।
प्रयोगशाला संस्कृति में किए गए संभोग प्रयोगों से पता चला है कि संयुग्मन आवृत्ति कई कारकों से प्रभावित होती है, जिसमें प्राप्तकर्ता कोशिकाओं की प्रकृति, विकास चरण, कोशिका घनत्व, दाता-से-प्राप्तकर्ता अनुपात, चाहे संयुग्मन तरल या ठोस मीडिया, कार्बन, ऑक्सीजन, पित्त लवण, धातु सांद्रता, स्तनधारी कोशिकाओं की उपस्थिति, तापमान, पीएच और संभोग समय13,14 में आयोजित किया जाता है। 15.
यह काम किसी दिए गए मेजबान तनाव में वैवाहिक प्लास्मिड की उपस्थिति का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, ठोस संस्कृति में संयुग्मन दरों को निर्धारित करने के लिए, और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में उनके हस्तांतरण को दोगुना करने के लिए। इन प्रोटोकॉल का उपयोग अनुसंधान के लिए उपयुक्त प्राकृतिक वैवाहिक प्लास्मिड की पहचान के लिए पहले कदम के रूप में किया जा सकता है। वे सरलीकृत चरणों की न्यूनतम संख्या का उपयोग करते हैं क्योंकि उन्हें पैमाने पर कई स्रोतों (पर्यावरणीय, कॉमेंसल और रोगजनक) से प्राप्त बैक्टीरिया में वैवाहिक प्लास्मिड की उपस्थिति को स्क्रीन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है (दर्जनों से सैकड़ों दाताओं तक)।
इसके अलावा, यह पता लगाने के लिए परीक्षण कि क्या किसी दिए गए वैवाहिक प्लास्मिड की लामबंदी पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक से स्वतंत्र है (यानी, चयन के तहत एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन की प्रासंगिकता) और विभिन्न पर्यावरणीय आइसोलेट्स में पाए जाने वाले दो वैवाहिक प्लास्मिड की संयुग्मन दरों की तुलना करने के लिए परीक्षण दिखाए गए हैं।
प्रासंगिक वैवाहिक प्लास्मिड (प्लास्मिड रिप्लिकॉन और एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन मेकअप) की आनुवंशिक संरचना के आधार पर, प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण को संयुग्मन दर को प्रभावित करने की संभावना वाले विभिन्न कारकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।
सामान्य प्रयोगात्मक डिजाइन:
संभोग प्रयोग स्थापित करने के लिए आवश्यक आवश्यक घटक दाता कोशिकाएं, एक प्राप्तकर्ता तनाव, और दाताओं (एंटीबायोटिक ए), प्राप्तकर्ताओं (एंटीबायोटिक बी), और ट्रांसकोनजुगेंट्स (एंटीबायोटिक ए और बी) का चयन करने के लिए ठोस मीडिया हैं। ट्रांसकोनजुगेंट्स प्राप्तकर्ता कोशिकाएं हैं जो दाता के वैवाहिक प्लास्मिड को स्थिर रूप से बनाए रखती हैं।
दाता कोशिकाएं एंटीबायोटिक (एंटीबायोटिक ए) के लिए प्रतिरोधी होती हैं और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं (एंटीबायोटिक बी) का चयन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मार्कर या मार्करों के लिए अतिसंवेदनशील होती हैं। एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के जीनोमिक स्थान (यानी, चाहे वह गुणसूत्र में स्थित हो या दाता कोशिका के प्लास्मिड में स्थित हो) को प्राथमिकता से ज्ञात करने की आवश्यकता नहीं है, क्योंकि प्राप्तकर्ता को एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्करों को जुटाना (प्रत्यक्ष दाता-प्राप्तकर्ता संपर्क के बाद) का अर्थ है कि दाता-प्रदान किए गए मार्कर प्लास्मिड में थे।
एक प्राप्तकर्ता तनाव (संयुग्मित प्लास्मिड लेने के लिए जाना जाता है) को दाता में मौजूद नहीं होने वाले स्थिर चयन योग्य मार्कर की आवश्यकता होती है; यह चयन योग्य मार्कर आम तौर पर गुणसूत्र में स्थित एंटीबायोटिक या बायोसाइड के लिए प्रतिरोधी होता है। संभोग प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले प्राप्तकर्ता का चयन महत्वपूर्ण है, क्योंकि कुछ ई कोलाई उपभेदों में वैवाहिक प्लास्मिड लेने की उनकी क्षमता भिन्नहोती है।
एक बार जब ये घटक स्थापित हो जाते हैं, तो कोई भी कॉलोनी जो दाता-प्राप्तकर्ता जोड़ी संपर्क के बाद दोनों एंटीबायोटिक दवाओं (ए और बी) के साथ मीडिया पर बढ़ती है, वह एक कथित ट्रांसकोनजुगेंट है (चित्रा 1)। यह माना जाता है कि दाता एंटीबायोटिक ए के साथ मीडिया में बढ़ सकते हैं, लेकिन एंटीबायोटिक बी के साथ मीडिया में नहीं बढ़ सकते हैं, और प्राप्तकर्ता एंटीबायोटिक बी के साथ मीडिया में बढ़ने में सक्षम हैं, लेकिन एंटीबायोटिक ए के साथ बढ़ने में सक्षम नहीं हैं। पहले परीक्षण में ट्रांसकोनजुगेंट कॉलोनियों में वैवाहिक प्लास्मिड में पाए जाने वाले जीनों का पता लगाना (पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन [पीसीआर] जीन के प्रवर्धन, या अन्य तरीकों से) शामिल है। दूसरे परीक्षण में लैक्टोज चयापचय के आधार पर विभेदक कॉलोनी रंग मार्करों का उपयोग शामिल है। अंतर कॉलोनी रंग मैककॉन्की एगर के उपयोग से प्रकट होता है; आगर में लैक्टोज का उपयोग लैक्टोज-किण्वन (लाख +) सूक्ष्मजीवों द्वारा किण्वन स्रोत के रूप में किया जा सकता है। ये सूक्ष्मजीव कार्बनिक एसिड, विशेष रूप से लैक्टिक एसिड का उत्पादन करते हैं, जो पीएच को कम करते हैं। न्यूट्रल रेड मीडिया में शामिल एक पीएच संकेतक है जो ऑफ-व्हाइट से चमकदार लाल / गुलाबी में बदल जाता है क्योंकि पीएच 6.817 से नीचे गिर जाता है। इस प्रकार, ई कोलाई लैक्टोज-पॉजिटिव उपभेद मैककॉन्की एगर पर बड़ी गुलाबी कॉलोनियों का उत्पादन करते हैं, जबकि लैक्टोज-नकारात्मक उपभेद मैककॉनकी एगर पर हल्के पीले और छोटे उपनिवेशों का उत्पादन करते हैं।
चित्रा 1: दाता उपभेदों में वैवाहिक प्लास्मिड की उपस्थिति का पता लगाने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन का उपयोग किया जाता है। इस उदाहरण में, दाता एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के साथ एक वैवाहिक प्लास्मिड को वहन करता है जो एंटीबायोटिक ए के लिए प्रतिरोध प्रदान करता है, लेकिन वे एंटीबायोटिक बी के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। इसके विपरीत, प्राप्तकर्ता में एक क्रोमोसोमल प्रतिरोध निर्धारक होता है जो एंटीबायोटिक बी से सुरक्षा प्रदान करता है, लेकिन यह एंटीबायोटिक ए के लिए अतिसंवेदनशील होता है। ट्रांसकोनजुगेंट्स दोनों एंटीबायोटिक दवाओं (ए और बी) के लिए प्रतिरोधी होते हैं, क्योंकि उनके पास दाता का वैवाहिक प्लास्मिड है जो एंटीबायोटिक ए और प्राप्तकर्ता के गुणसूत्र के लिए प्रतिरोध प्रदान करता है जो एंटीबायोटिक बी से सुरक्षा प्रदान करता है।
दाता-प्राप्तकर्ता जोड़ी (दी गई प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत) के लिए संयुग्मन दर की गणना दाताओं की संख्या या प्राप्तकर्ताओं की संख्या से ट्रांसकोन्जुगेंट्स की संख्या को विभाजित करके की जा सकती है; पहली दर दाता16,18 द्वारा संयुग्मन मशीनरी की कार्यात्मक अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करने वाले दाता कोशिकाओं के अंश को इंगित करती है, जबकि दूसरी दर प्राप्तकर्ता की वैवाहिक प्लास्मिड19,20 लेने की क्षमता को इंगित करती है। इस अध्ययन में, जब तक अन्यथा नहीं कहा गया है, संयुग्मन दर प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के अंश का प्रतिनिधित्व करती है जो ट्रांसकोनजुगेंट (यानी, प्रति प्राप्तकर्ता दर) बन जाते हैं।
यहां, दो स्वतंत्र संभोग प्रयोगों की सूचना दी गई है, जिसमें एक ई कोलाई प्राप्तकर्ता और दो ई कोलाई दाता शामिल हैं। इसके अलावा, दाताओं में से एक के लिए ट्रांसकोनजुगेंट्स का चयन करने के लिए विभिन्न एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग किया गया था ताकि यह पुष्टि की जा सके कि एक एकल मल्टीड्रग-प्रतिरोधी प्लास्मिड को वैवाहिक प्लास्मिड में पाए जाने वाले किसी भी एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के साथ चुना जा सकता है।
इस काम में उपयोग किए जाने वाले दाता और प्राप्तकर्ता उपभेदों को इस प्रयोगात्मक प्रणाली के सभी घटकों को समझने के लिए पूरी तरह से अनुक्रमित किया गया है; हालांकि, इन प्रोटोकॉल को अज्ञात अनुक्रम के मेजबानों में वैवाहिक प्लास्मिड की उपस्थिति के लिए स्क्रीन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, और इसका उपयोग इस प्रयोगात्मक संदर्भ में भी किया जा सकता है; हालांकि, इस मामले में, संबंधित जीन पहले अनुक्रमित होते हैं।
प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले दाता और प्राप्तकर्ता उपभेद निम्नलिखित हैं:
दाता 1. ई कोलाई SW4955 बैटन रूज (एलए, यूएसए) में एक झील में एकत्र किया गया था। इसमें 134,797 बीपी वैवाहिक प्लास्मिड (पी 134797) है, जिसमें इंकफिक (एफआईआई) और इंकएफआईबी (एपी001918) रिप्लिकॉन हैं। इस वैवाहिक प्लास्मिड में जीन होते हैं जो तीसरी पीढ़ी के सेफलोस्पोरिन (बीएलएसीटीएक्स-एम -55), एमिनोग्लाइकोसाइड्स (एएसी (3)-आईआईए और एडीए 1), फेनिकॉल्स (कैटए 2), टेट्रासाइक्लिन (टेट (ए)), ट्राइमेथोप्रिम (डीएफआरए 14), और सल्फोनामाइड्स (सुल 3) के प्रतिरोध प्रदान करते हैं। p134797 के पूर्ण मानचित्र के लिए, कृपया चित्र 2A देखें। ई कोलाई एसडब्ल्यू 4955 लैक्टोज-पॉजिटिव है, जो मैककॉन्की एगर पर गुलाबी कॉलोनियों का उत्पादन करता है।
दाता 2. ई कोलाई SW7037 झील एरी (ओटावा काउंटी, ओएच, यूएसए) में एकत्र किया गया था। इसमें 101,718 बीपी संयुग्मित प्लास्मिड (पी 101718) होता है, जिसमें एक इंकआई 1-आई (अल्फा) रिप्लिकॉन होता है। इस वैवाहिक प्लास्मिड में एक जीन होता है जो बीटा-लैक्टम (बीएलएसीएमवाई -2) के लिए प्रतिरोध प्रदान करता है। p101718 के पूर्ण मानचित्र के लिए, कृपया चित्र 2B देखें। ई कोलाई एसडब्ल्यू 7037 लैक्टोज-पॉजिटिव भी है, जो मैककॉन्की एगर पर गुलाबी कॉलोनियों का उत्पादन करता है।
चित्रा 2: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले वैवाहिक प्लास्मिड का आनुवंशिक मानचित्र। (ए) प्लास्मिड पी 134797, ई कोलाई स्ट्रेन एसडब्ल्यू 4955 में पाया जाने वाला वैवाहिक प्लास्मिड। (बी) प्लास्मिड पी 101718, ई कोलाई स्ट्रेन एसडब्ल्यू 7037 में पाया जाने वाला वैवाहिक प्लास्मिड। एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन को नीले रंग में हाइलाइट किया जाता है, और वैवाहिक तंत्र से संबंधित जीन को लाल रंग में हाइलाइट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
प्राप्तकर्ता. ई कोलाई LMB100 प्राप्तकर्ता के रूप में प्रयोग किया जाता है। यह एक प्लास्मिडलेस स्ट्रेन है जो रिफैम्पिन (100 मिलीग्राम / एल) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 मिलीग्राम / एल) के लिए प्रतिरोधी है। दो एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिरोध होने से दाता में उत्पन्न प्रतिरोध उत्परिवर्तन की संभावना कम हो जाती है जो परिणामों की व्याख्या में हस्तक्षेप करेगी। इसके अलावा, ई कोलाई एलएमबी 100 लैक्टोज-नकारात्मक है, और इसे दो दाता उपभेदों से अलग किया जा सकता है क्योंकि यह मैककॉन्की एगर पर हल्के पीले और छोटे उपनिवेशों (बड़ी, गुलाबी कॉलोनियों के विपरीत) का उत्पादन करता है।
जब दाता लैक्टोज-नकारात्मक होता है, तो हम लैक्टोज-पॉजिटिव प्राप्तकर्ता (जैसे, ई कोलाई जे 53) का उपयोग करने की सलाह देते हैं। एलएमबी 100 और जे 53 उपभेद उपयोग के लिए अन्य प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध हैं। कृपया एक पते और FedEx नंबर के साथ डॉ गेरार्डो कोर्टेस-कोर्टेस को एक अनुरोध भेजें।
दाताओं, प्राप्तकर्ताओं और ट्रांसकॉन्जुगेंट्स का चयन करने और गिनने के लिए आवश्यक ठोस मीडिया 100 मिमी व्यास में पेट्री व्यंजन में मैककॉनकी एगर है। निम्नलिखित एंटीबायोटिक दवाओं के अतिरिक्त की आवश्यकता है: (i) मीडिया ए: कार्बेनिसिलिन (100 मिलीग्राम / एल) दाताओं की गिनती करने के लिए और यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्राप्तकर्ता इस एंटीबायोटिक के साथ नहीं बढ़ सकते हैं। (ii) मीडिया बी: रिफैम्पिन (100 मिलीग्राम / एल) + स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 मिलीग्राम / एल) प्राप्तकर्ताओं की गिनती करने और यह सुनिश्चित करने के लिए कि दाता इन दो एंटीबायोटिक दवाओं में नहीं बढ़ सकते हैं। (iii) ट्रांसकोनजुगेंट्स प्राप्त करने और गिनने के लिए मीडिया एबी: कार्बेनिसिलिन (100 मिलीग्राम/लीटर) + रिफैम्पिन (100 मिलीग्राम/एल) + स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 मिलीग्राम/एल)। (iv) मीडिया सी: अध्ययन किए गए सभी आइसोलेट्स को लागू करने के लिए कोई एंटीबायोटिक्स नहीं।
ई कोलाई एसडब्ल्यू 4955 और ई कोलाई एसडब्ल्यू 7037 से ई कोलाई एलएमबी 100 तक वैवाहिक प्लास्मिड की संयुग्मन दर की तुलना की जाती है। इसके अलावा, पी 134797 वैवाहिक प्लास्मिड (एसडब्ल्यू 4955 स्ट्रेन) के मामले में, एंटीबायोटिक कार्बेनिसिलिन (100 मिलीग्राम / एल) को जेंटामाइसिन (2 मिलीग्राम / एल), क्लोरैम्फेनिकॉल (25 मिलीग्राम / एल), टेट्रासाइक्लिन (10 मिलीग्राम / एल), ट्राइमेथोप्रिम (20 मिलीग्राम / एल), या सल्फामेथोक्साज़ोल (100 मिलीग्राम / एल) द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है ताकि यह स्थापित किया जा सके कि चयन के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर का कोई प्रभाव पड़ता है या नहीं।
वैवाहिक प्लास्मिड पुनर्संयोजन और क्षैतिज जीन स्थानांतरण के माध्यम से एक विशेष पर्यावरणीय सेटिंग के भीतर जीन के सांप्रदायिक पूल तक पहुंच प्रदान करतेहैं। इस प्रकार, वैवाहिक प्लास्मिड विकासवादी संस्थाएं हैं जो कार्यों को प्राप्त करने और प्रदान करने में सक्षम हैं जो बैक्टीरिया को घंटों के अस्थायी पैमाने के भीतर कई स्थितियों (एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिरोध, धातुओं के प्रतिरोध, धातुओं के लिए प्रतिरोध, धातुओं के अधिग्रहण, बायोफिल्म गठन और रोगजनक जीन सहित) के अनुकूल होने की अनुमति देती हैं।
यह काम बैक्टीरिया में वैवाहिक प्लास्मिड की पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल के काम करने के लिए, उपयोग किए गए मार्करों को दाता और प्राप्तकर्ता उपभेदों को अलग करने की आवश्यकता होती है, जैसा कि मीडिया ए और बी में नियंत्रण द्वारा दिखाया गया है। उन्हें प्लास्मिड ले जाने वाली कोशिकाओं का प्रभावी ढंग से चयन करने की भी आवश्यकता होती है। संभोग प्रतिक्रिया महत्वपूर्ण है। इस प्रतिक्रिया में, दाताओं और प्राप्तकर्ताओं को संयुग्मन होने के लिए लंबे समय तक संपर्क (पिली के माध्यम से) करने की आवश्यकता होती है। कुछ भी जो सेल-टू-सेल संपर्क को बाधित कर सकता है, जैसे कि अपर्याप्त इनक्यूबेशन समय या संस्कृति को हिलाना या हिलाना, इस प्रकार संयुग्मन की दक्षता कम हो जाती है। प्राप्तकर्ता की पसंद भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि कुछ प्राप्तकर्ता उपभेद संयुग्मन35,36 के लिए दुर्दम्य हैं। एलएमबी 100 को पसंद के प्राप्तकर्ता के रूप में प्रस्तावित किया गया है, क्योंकि यह कई असंगति प्रकारों के प्लास्मिड लेने में सक्षम है।
संयुग्मन दर प्रत्येक प्लास्मिड-दाता गुणसूत्र जोड़ी, प्राप्तकर्ता और पर्यावरणीय स्थिति के लिए विशिष्ट है। विशिष्ट प्लास्मिड का संयुग्मन बड़ी संख्या में चर के प्रति संवेदनशील पाया गया है, जिसमें विकास चरण, सेल घनत्व, दाता-से-प्राप्तकर्ता अनुपात शामिल है, चाहे संयुग्मन तरल या ठोस मीडिया, कार्बन, ऑक्सीजन, पित्त लवण, धातु सांद्रता, स्तनधारी कोशिकाओं की उपस्थिति, तापमान, पीएच और संभोग समय 13,14,15 में आयोजित किया गया हो। . इन इंटरैक्शन का अध्ययन गहराई से अध्ययन किए जाने वाले एक वैवाहिक प्लास्मिड की प्रारंभिक पहचान पर निर्भर करता है। इस प्रकार, यहां वर्णित प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रयोगात्मक चर के प्रभाव का पता लगाने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है, हालांकि यह स्क्रीन किए गए दाताओं की संख्या को प्रतिबंधित करने की कीमत पर आता है। यह मेजबानों में मोबिलाइजेबल प्लास्मिड की भी पहचान कर सकता है जिनके पास हेल्पर प्लास्मिड हैं (यानी, प्लास्मिड जो ट्रांस6 में मोबिलाइजेबल प्लास्मिड से गायब कार्यों को प्रदान करके संयुग्मन को सक्षम करते हैं)।
वैवाहिक प्लास्मिड के अनुक्रम को जानने की सिफारिश की जाती है (लेकिन संयुग्मन का पता लगाने के लिए आवश्यक नहीं है, जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है)। जब दाता लैक्टोज-नकारात्मक होते हैं (मैककॉन्की एगर पर पीली कॉलोनियों का उत्पादन करते हैं), तो एक लैक्टोज-पॉजिटिव प्राप्तकर्ता (मैककॉनकी एगर पर गुलाबी कॉलोनियों का उत्पादन) का उपयोग दाता कोशिकाओं से सच्चे ट्रांसकॉन्जुगेंट्स को अलग करने के लिए किया जा सकता है जो ट्रांसकॉन्जुगेंट्स का चयन करने के लिए मीडिया पर बढ़ने में सक्षम हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को एंटरोबैक्टीरिया परिवार के पर्यावरणीय, कॉमेंसल और रोगजनक सदस्यों से वैवाहिक प्लास्मिड का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया है; हालांकि, इसका उपयोग किसी भी जीवाणु प्रजाति के साथ उपयुक्त दाता, प्राप्तकर्ता, एंटीबायोटिक (ओं) और रंग मार्करों के साथ किया जा सकता है। अन्य बैक्टीरिया में इन महत्वपूर्ण घटकों की पहचान के लिए कई दाताओं, प्राप्तकर्ताओं और मार्करों (एंटीबायोटिक्स और रंगों) का उपयोग करके व्यवस्थित अध्ययन की आवश्यकता होती है। ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया में इस प्रोटोकॉल का परीक्षण नहीं किया गया है।
यहां प्रस्तुत विधि के कई रूपों को साहित्य में बताया गया है, हाल ही में समीक्षा की गई20। गुणात्मक परिणाम को विभिन्न तरीकों से भी संदर्भित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एक्सकोनजुगेंट आवृत्ति और जीन हस्तांतरण आवृत्ति), और आयाम रहित इकाइयों का उपयोग संयुग्मन दक्षता (एमएल / सीएफयू एक्स एच) 20 की रिपोर्ट करने के लिए किया जा सकता है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल कई सीमाओं को हल करता है जो पहले मौजूदा तरीकों 16,18,19,20 द्वारा संबोधित नहीं किए गए थे। सबसे पहले, एक उपयुक्त प्राप्तकर्ता की पहचान की गई है। दूसरा, सच्चे ट्रांसकोनजुगेंट्स का चयन करने के लिए दो एंटीबायोटिक दवाओं (रिफैम्पिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) का उपयोग इस संभावना को कम करता है कि दाता सहज म्यूटेनेसिस के माध्यम से ट्रांसकोनजुगेंट्स का चयन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक दवाओं में से एक के लिए प्रतिरोध विकसित करते हैं। दाता द्वारा बड़ी मात्रा में उत्पादित एंजाइमों (जैसे, बीटा-लैक्टामेस) द्वारा ट्रांसकोनजुगेंट्स का चयन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक के हाइड्रोलिसिस द्वारा झूठी ट्रांसकोनजुगेंट्स द्वारा दर्शक संरक्षण के परिणामस्वरूप भी हो सकते हैं। तीसरा, यह सुनिश्चित करने के लिए कई प्रयोगात्मक नियंत्रण शामिल हैं कि संभोग का उत्पाद एक सच्चा ट्रांसकोनजुगेंट है (यानी, एक प्राप्तकर्ता सेल जिसने दाता के वैवाहिक प्लास्मिड को स्थिर रूप से शामिल किया है)। यहां, हमने ट्रांसकोनजुगेंट्स की प्रामाणिकता का परीक्षण करने के लिए दो स्वतंत्र तरीके प्रस्तुत किए, अर्थात् मैककॉन्की एगर में एक रंगीन मार्कर, और प्राप्तकर्ता में वैवाहिक प्लास्मिड के रिप्लिकॉन और एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन का पीसीआर पता लगाना। इसके अलावा, यहां वर्णित प्रोटोकॉल को पर्यावरणीय, कमेंसल और परिवार के रोगजनक सदस्यों (एस्चेरिचिया, क्लेबसिएला, एंटरोबैक्टर, सिट्रोबैक्टर, साल्मोनेला, शिगेला और अन्य प्रजातियों) से वैवाहिक प्लास्मिड को अलग करने और चिह्नित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
संयुग्मन के यांत्रिकी को समझने के लिए, कंप्यूटर सिमुलेशन का उपयोग करके प्रयोगात्मक टिप्पणियों का मॉडलिंग किया गया है। ये पूर्वानुमानित मॉडल दाताओं, प्राप्तकर्ताओं और ट्रांसकोनजुगेंट्स के दिए गए विकास घनत्व के लिए प्लास्मिड हस्तांतरण की आवृत्ति का अनुमान लगाते हैं। एंडपॉइंट मॉडल के रूप में जाना जाने वाला एक मॉडल ने थ्रेसहोल्ड पाया जिसके ऊपर तरल संस्कृति में प्लास्मिड ट्रांसफर की दर थी, और निष्कर्ष निकाला कि स्थानांतरण दर सेल घनत्व, दाता: प्राप्तकर्ता अनुपात और संभोग समय19 से अप्रभावित है। फ्लोरेसेंस इन सीटू संकरण (फिश) का उपयोग ट्रांसकोनजुगेंट प्लास्मिड का पता लगाने की वैकल्पिक विधि के रूप में किया गया है। मछली डीएनए जांच और लक्ष्य डीएनए के संकरण के माध्यम से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्लास्मिड विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती है। इस प्रकार, फिश विभिन्न सेल आबादी37 में प्लास्मिड प्रवाह का दृश्य पता लगाने की अनुमति देता है, हालांकि इसमें यहां प्रस्तुत विधि के समान संवेदनशीलता नहीं है यदि चयन के विपरीत दृश्य स्क्रीनिंग द्वारा ट्रांसकोन्जुगेंट्स का पता लगाया जाता है।
वैवाहिक प्लास्मिड के जीव विज्ञान को समझने की भारी आवश्यकता है जो पारिस्थितिकी तंत्र के विभिन्न घटकों (क्लिनिक, कृषि, सीवेज, वन्यजीव, घरेलू जानवरों, मिट्टी, नदियों और झीलों) के माध्यम से एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन को फैला रहे हैं। संक्षेप में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल में प्रस्तुत सरलीकृत प्रयोगात्मक स्थितियां पैमाने पर दाताओं की स्क्रीनिंग की सुविधा प्रदान करती हैं, और इस प्रकार विभिन्न स्रोतों से वैवाहिक प्लास्मिड में उत्पन्न क्षैतिज जीन हस्तांतरण के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करती हैं। उनका उपयोग कई स्रोतों और बैक्टीरिया से वैवाहिक प्लास्मिड में एंटीबायोटिक-प्रतिरोध जीन या अन्य चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक जीन की व्यापकता की जांच करने के लिए किया जा सकता है। उन्हें विवो में संयुग्मन के अध्ययन के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, कशेरुक की आंत में) और उन स्थितियों का अध्ययन करने के लिए जो संयुग्मन की दक्षता को संशोधित करते हैं। ये सभी अध्ययन यह समझने में बहुत वृद्धि करेंगे कि मल्टीड्रग-प्रतिरोधी वैवाहिक प्लास्मिड की लामबंदी मल्टीड्रग प्रतिरोध के प्रसार में कैसे योगदान देती है।
The authors have nothing to disclose.
एलएम-बी, आईएमजी, एटी और आईएस को एनआईएच अनुदान जीएम 055246 द्वारा समर्थित किया गया था। जीसी-सी को लगातार दो वर्षों के लिए यूसी एमईएक्सयूएस-कोनासाइट पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप से सम्मानित किया गया: एवाई 2017-18 और 2018-19। हम प्रयोगों में उनके तकनीकी समर्थन के लिए जेनटेक-फाउंडेशन प्रायोजित अकादमिक प्रेरणा नेटवर्क (जीएआईएन) सलाह कार्यक्रम से सेज शावेज और पेपर सेंट क्लेयर के छात्रों को बहुत धन्यवाद देते हैं।
1.5 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 22-313630 | It can be replaced for another brand |
2.0 mL Cryogenic vials | Corning | 430659 | It can be replaced for another brand |
14 mL conical tubes | FALCON | 149597 | It can be replaced for another brand |
14 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 8850 | It can be replaced for another brand |
1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N0552G | |
250 mL sterile flasks | PYREX | 5320 | It can be replaced for another permanent marker brand |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38SI-212 | It can be replaced for another brand |
Agarose (molecular biology grade, multipurpose) | Fisher Scientific | BP160-500 | It can be replaced for another brand |
Carbenicillin | GOLD BIOTECHNOLOGY | C-103-50 | It can be replaced for another brand |
Disposable inoculating loops: 1 µL | Fisherbrand | 22-363-595 | It can be replaced for another brand |
DNA gel loading dye 6x | New England Biolabs | B7024S | It can be replaced for another brand |
EDTA | Fisher Scientific | BP119-500 | It can be replaced for another brand |
Electronic digital scale | Denver Instrument | APX-2001 | It can be replaced for another brand |
Eppendorf conical tubes: 1.5 mL | Eppendorf | 14-282-302 | It can be replaced for another brand |
Equipment for agarose gel electrophoresis | Fisher Scientific | FP300 | It can be replaced for another brand |
Ethanol-resistant markers | Sharpie | 37001; 37002; 37003 | It can be replaced for another brand |
Gel documentation systems (UVP GelSolo) | Analytakjena | SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01 | It can be replaced for another brand |
Gloves | X-GEN | 44-100M | Any nitrile gloves brand works |
Ice bucket | Thermo Fisher Scientific | 432128 | It can be replaced for another brand |
MacConkey agar | BD DIFCO | 212123 | |
Master Mix | BioLabs | M0496S | It can be replaced for another brand |
Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | It can be replaced for another brand |
Microcentrifuge tubes: 2.0 mL | Fisherbrand | 05-408-138 | It can be replaced for another brand |
Mueller Hinton agar | BD DIFCO | DF0479-17-3 | |
Mueller Hinton broth | BD DIFCO | 275730 | |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL | 740588. 250 | |
PCR tube racks | AXYGEN | R96PCRFSP | It can be replaced for another brand |
PCR tubes (0.2 mL) | AXYGEN | PCR-02-C | It can be replaced for another brand |
Rifampicin | Fisher Scientific | 50-164-7517 | |
Set of micropipettes that dispense between 1 – 10 μL (P10), 2–20 μL (P20), 20–200 μL (P200) and 200–1000 μL (P1000) | RAININ | 17008648; 17008650; 17008652; 17008653 | Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-3 | It can be replaced for another brand |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | 335905P | It can be replaced for another brand |
Sterilized tips for 10 μL, 200 μL and 1000 μL | Eclipse | 1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9 | It can be replaced for another brand |
Streptomycin | Fisher Scientific | BP910-50 | |
SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
Taq DNA Polymerase | BioLabs | M0273S | |
Thermal cycler C1000 Touch | Bio-Rad | 1851196 | It can be replaced for another brand |
Tris | Fisher Scientific | BP153-500 | It can be replaced for another brand |