Detta protokoll beskriver en flödescytometribaserad screeningmetod med hög genomströmning för att identifiera småmolekylära läkemedel som hämmar β2-integrinaktivering på humana neutrofiler.
Detta protokoll syftar till att etablera en metod för att identifiera små molekylära antagonister av β2-integrinaktivering, med hjälp av antikroppar som rapporterar konformationsförändringar och flödescytometri med hög genomströmning. Metoden kan också fungera som en guide för andra antikroppsbaserade screeningmetoder med hög kapacitet. β2-integriner är leukocytspecifika adhesionsmolekyler som är avgörande för immunsvar. Neutrofiler är beroende av integrinaktivering för att lämna blodomloppet, inte bara för att bekämpa infektioner utan också för att vara involverade i flera inflammatoriska sjukdomar. Att kontrollera aktiveringen av β2-integrin är ett gångbart tillvägagångssätt för behandling av neutrofilassocierade inflammatoriska sjukdomar. I detta protokoll används en monoklonal antikropp, mAb24, som specifikt binder till högaffinitetsstycket i β2-integriner, för att kvantifiera β2-integrinaktivering på isolerade primära humana neutrofiler. N-formylmetionylleucylfenylalanin (fMLP) används som en stimulans för att aktivera neutrofila β2-integriner. En flödescytometer med hög genomströmning som automatiskt kan köra 384-brunnars plattprover användes i denna studie. Effekterna av 320 kemikalier på hämning av β2-integrin bedöms inom 3 timmar. Molekyler som direkt riktar sig mot β2-integriner eller målmolekyler i den G-proteinkopplade receptorinitierade integrin-inifrån och ut-aktiveringssignalvägen kan identifieras genom detta tillvägagångssätt.
Många inflammatoriska sjukdomar kännetecknas av infiltration av neutrofiler på platsen för svullnad eller skada1. För att infiltrera dessa vävnader måste neutrofiler slutföra neutrofilrekryteringskaskaden, vilket innebär att endotelet arresteras, extravasering över kärlväggen och rekrytering till vävnad2. Cirkulerande neutrofiler behöver β2-integrinaktivering för att fullborda denna kaskad, särskilt för stoppfasen. Integrinhämmande läkemedel som minskar adhesion, extravasering och rekrytering av neutrofila granulocyter kan således effektivt behandla inflammatoriska sjukdomar 3,4.
β2-integriner har tidigare varit måltavla för inflammatoriska sjukdomar. Efalizumab, en monoklonal antikropp som direkt riktar sig mot integrin αLβ2, utvecklades för att behandla psoriasis5. efalizumab sattes dock ut på grund av dess dödliga biverkning – progressiv multifokal leukoencefalopati till följd av reaktivering av JC-virus 6,7. Nya antiinflammatoriska integrinbaserade terapier bör överväga att upprätthålla leukocyternas infektionshämmande funktioner för att minimera biverkningarna. Biverkningarna av efalizumab kan bero på den förlängda cirkulationen av monoklonala antikroppar i blodomloppet, vilket kan hämma immunfunktioner på lång sikt8. En nyligen genomförd studie visar att efalizumab medierar αLβ2-tvärbindning och oönskad internalisering av α4-integriner, vilket ger en alternativ förklaring till biverkningarna9. Således kan kortlivade, småmolekylära antagonister undvika detta problem.
En storskalig metod för att screena småmolekylära β2-integrinantagonister med hjälp av humana neutrofiler presenteras här. β2-integrinaktivering kräver konformationsförändringar av integrinektodomänen för att få tillgång till och öka dess bindningsaffinitet till dess ligand. I den kanoniska switchblade-modellen sträcker sig den böjda integrinektodomänen först till en utsträckt-sluten konformation och öppnar sedan sitt huvudstycke till en fullt aktiverad utsträckt-öppen konformation10,11,12,13. Det finns också en alternativ väg som börjar från den böjda stängda till böjd-öppen och utsträckt-öppen, så småningom 14,15,16,17,18,19. Den konformationsspecifika antikroppen mAb24 binder till en epitop i den humana β2-I-liknande domänen när ektodomänens huvudstycke är öppet20,21,22,23.
Här används mAb24-APC för att avgöra om β2-integrinerna är aktiverade. För att aktivera neutrofiler och integrin används N-formylmetionyl-leucylfenylalanin (fMLP), en bakteriehärledd kort kemotaktisk peptid som kan aktivera neutrofila β2-integriner24, som en stimulans i detta protokoll. När fMLP binder till Fpr1 på neutrofiler aktiveras nedströms signalkaskader som involverar G-proteiner, fosfolipas Cβ och fosfoinositid-3-kinas γ. Dessa signaleringshändelser resulterar i slutändan i integrinaktivering via inifrån och ut-signalvägen18,25. Förutom småmolekylära antagonister som direkt binder till β2-integriner och förhindrar konformationsförändringar av integrinaktivering26, skulle föreningar som kan hämma komponenter i β2-integrin-inifrån och ut-aktiveringssignalvägen också detekteras med denna metod. Automatiserade flödescytometrar möjliggör screening med hög genomströmning. Att identifiera nya antagonister kan inte bara fördjupa vår förståelse av integrinfysiologi utan också ge translationell insikt i integrinbaserad antiinflammatorisk terapi.
Initiering och avslutning av stimulering och färgning av neutrofila granulocyter bestäms genom tillsats av neutrofiler och fixeringsmedlet PFA. Därför är det viktigt att säkerställa samma tidsintervall mellan pipettering av neutrofiler eller PFA i varje kolonn. Detta säkerställer att stimulerings- och färgningstiden för neutrofiler från varje brunn förblir konsekvent. På grund av neutrofilernas korta livslängd måste hela experimentet, från insamling av blod från givare till fullständig flödescytometri…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. Evan Jellison och Ms. Li Zhu i flödescytometrikärnan vid UConn Health för deras hjälp med flödescytometri, Dr. Lynn Puddington i avdelningen för immunologi vid UConn Health för hennes stöd till instrumenten, Ms. Slawa Gajewska och Dr. Paul Appleton i den kliniska forskningskärnan vid UConn Health för deras hjälp med att ta blodprover. Vi tackar Dr. Christopher “Kit” Bonin och Dr. Geneva Hargis från UConn School of Medicine för deras hjälp med vetenskapligt skrivande och redigering av detta manuskript. Denna forskning stöddes av anslag från National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), USA, ett Career Development Award från American Heart Association (18CDA34110426) och en startfond från UConn Health. Figur 1 skapades med BioRender.com.
16-channel pipettes | Thermo | 4661090N | Instrument |
384-well plate | Greiner | 784201 | Materials |
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 | BioLegend | 363410 | Reagents |
Bravo Automated Liquid Handling Platform | Agilent | 16050-102 | 384 multi-channel liquid handler |
Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | Instrument |
FlowJo | Becton, Dickinson & Company | NA | Software |
Human Serum Albumin Solution (25%) | GeminiBio | 800-120 | Reagents |
Lifitegrast | Thermofisher | 50-208-2121 | Reagents |
Nexinhib20 | Tocris | 6089 | Reagents |
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | F3506 | Reagents |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagents |
Plate buckets | Eppendorf | UL155 | Accessory |
Plate shaker | Fisher | 88-861-023 | Instrument |
PolymorphPrep | PROGEN | 1895 (previous 1114683) | Reagents |
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) | Prestwick Chemical Libraries | Ver19_384 | 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved) |
RPMI 1640 Medium, no phenol red | Gibco | 11-835-030 | Reagents |
Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | Rotor |
ZE5 Cell Analyzer | Bio-Rad Laboratories | Model ZE5 | Instrument |