Denne protokollen beskriver en flowcytometribasert, høy gjennomstrømningsscreeningsmetode for å identifisere småmolekylære legemidler som hemmer β2-integrinaktivering på humane nøytrofiler.
Denne protokollen tar sikte på å etablere en metode for å identifisere små molekylære antagonister av β2-integrinaktivering, ved bruk av konformasjonsendringsrapporterende antistoffer og høy gjennomstrømningscytometri. Metoden kan også tjene som en veiledning for andre antistoffbaserte screeningsmetoder med høy gjennomstrømning. β2-integriner er leukocyttspesifikke adhesjonsmolekyler som er avgjørende for immunresponser. Neutrofiler stole på integrinaktivering for å gå ut av blodet, ikke bare for å bekjempe infeksjoner, men også for å være involvert i flere inflammatoriske sykdommer. Kontroll av β2-integrinaktivering gir en levedyktig tilnærming for behandling av nøytrofilassosierte inflammatoriske sykdommer. I denne protokollen brukes et monoklonalt antistoff, mAb24, som spesifikt binder seg til hodestykket med høy affinitet av β2-integriner, for å kvantifisere β2-integrinaktivering på isolerte primære humane nøytrofiler. N-formylmetionyl-leucyl-fenylalanin (fMLP) brukes som et stimulus for å aktivere nøytrofile β2-integriner. Et cytometer med høy gjennomstrømningsstrøm som er i stand til automatisk å kjøre 384-brønns plateprøver ble brukt i denne studien. Effektene av 320 kjemikalier på β2 integrinhemming vurderes innen 3 timer. Molekyler som direkte retter seg mot β2-integriner eller målmolekyler i G-proteinkoblet reseptorinitiert integrin innvendig ut aktiveringssignalvei, kan identifiseres gjennom denne tilnærmingen.
Mange inflammatoriske sykdommer er preget av infiltrering av nøytrofiler på stedet for hevelse eller skade1. For å infiltrere disse vevene, må nøytrofiler fullføre nøytrofil rekrutteringskaskade, som innebærer arrestasjon til endotelet, ekstravasasjon over karveggen og rekruttering til vevet2. Sirkulerende nøytrofiler trenger β2 integrinaktivering for å fullføre denne kaskaden, spesielt for arrestasjonsfasen. Dermed kan integrinhemmende legemidler som reduserer nøytrofil adhesjon, ekstravasasjon og rekruttering effektivt behandle inflammatoriske sykdommer 3,4.
β2 integriner har vært målrettet for inflammatoriske sykdommer før. Efalizumab, et monoklonalt antistoff direkte rettet mot integrin αLβ2, ble utviklet for å behandle psoriasis5. Efalizumab ble imidlertid seponert på grunn av den dødelige bivirkningen – progredierende multifokal leukoencefalopati som følge av reaktivering av JC-virus 6,7. Nye antiinflammatoriske integrinbaserte terapier bør vurdere å opprettholde antiinfeksjonsfunksjonene til leukocytter for å minimere bivirkninger. Bivirkningene av efalizumab kan skyldes langvarig sirkulasjon av monoklonale antistoffer i blodet, noe som kan hemme immunfunksjoner pålang sikt. En nylig studie viser at efalizumab medierer αLβ2-kryssbinding og uønsket internalisering av α4-integriner, noe som gir en alternativ forklaring på bivirkningene9. Dermed kan kortvarige, småmolekylære antagonister unngå dette problemet.
En høy gjennomstrømningsmetode for å skjerme småmolekylære β2-integrinantagonister ved bruk av humane nøytrofiler presenteres her. β2 integrinaktivering krever konformasjonsendringer av integrinektodomenet for å få tilgang til og øke bindingsaffiniteten til liganden. I den kanoniske springbladmodellen strekker det bøyde-lukkede integrinektodomenet seg først til en utvidet-lukket konformasjon og åpner deretter hodestykket for en fullt aktivert utvidet-åpen konformasjon10,11,12,13. Det finnes også en alternativ trasé som starter fra bøyd-lukket til bøyd-åpen og forlenget-åpen, til slutt 14,15,16,17,18,19. Det konformasjonsspesifikke antistoffet mAb24 binder seg til en epitop i det humane β2-I-lignende domenet når hodestykket til ektodomenet er åpent20,21,22,23.
Her brukes mAb24-APC for å bestemme om β2-integrinene er aktivert. For å aktivere nøytrofiler og integrin, brukes N-formylmetionyl-leucyl-fenylalanin (fMLP), et bakterielt avledet kort kjemotaktisk peptid som kan aktivere nøytrofile β2-integriner24, som et stimulus i denne protokollen. Når fMLP binder seg til Fpr1 på nøytrofiler, aktiveres nedstrøms signalkaskader som involverer G-proteiner, fosfolipase Cβ og fosfoinositid 3-kinase γ. Disse signalhendelsene resulterer til slutt i integrinaktivering via signalveieninnsiden ut 18,25. Foruten små molekylantagonister som direkte binder seg til β2-integriner og forhindrer konformasjonsendringer av integrinaktivering26, vil forbindelser som kan hemme komponenter i β2-integrinet innvendig ut aktiveringssignalvei også bli detektert med denne metoden. Automatiserte flowcytometre muliggjør screening med høy gjennomstrømning. Identifisering av nye antagonister kan ikke bare utdype vår forståelse av integrinfysiologi, men også gi translasjonell innsikt i integrinbasert antiinflammasjonsterapi.
Initiering og avslutning av nøytrofil stimulering og farging bestemmes ved tilsetning av nøytrofiler og fikseringsmiddel PFA. Derfor er det viktig å sikre samme tidsintervall mellom pipettering av nøytrofiler eller PFA i hver kolonne. Dette sikrer at stimulerings- og fargetiden til nøytrofiler fra hver brønn forblir konsistent. På grunn av den korte levetiden til nøytrofiler, må hele forsøket, fra å samle blod fra givere til å fullføre flowcytometri, utføres samme dag. Nøytrofile granulocytter er svært f?…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Evan Jellison og Li Zhu i flowcytometrikjernen ved UConn Health for deres hjelp med flowcytometri, Dr. Lynn Puddington ved Institutt for immunologi ved UConn Health for hennes støtte til instrumentene, Slawa Gajewska og Dr. Paul Appleton i den kliniske forskningskjernen ved UConn Health for deres hjelp med å skaffe blodprøver. Vi anerkjenner Dr. Christopher “Kit” Bonin og Dr. Geneva Hargis fra UConn School of Medicine for deres hjelp med vitenskapelig skriving og redigering av dette manuskriptet. Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), USA, en karriereutviklingspris fra American Heart Association (18CDA34110426), og et oppstartsfond fra UConn Health. Figur 1 ble laget med BioRender.com.
16-channel pipettes | Thermo | 4661090N | Instrument |
384-well plate | Greiner | 784201 | Materials |
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 | BioLegend | 363410 | Reagents |
Bravo Automated Liquid Handling Platform | Agilent | 16050-102 | 384 multi-channel liquid handler |
Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | Instrument |
FlowJo | Becton, Dickinson & Company | NA | Software |
Human Serum Albumin Solution (25%) | GeminiBio | 800-120 | Reagents |
Lifitegrast | Thermofisher | 50-208-2121 | Reagents |
Nexinhib20 | Tocris | 6089 | Reagents |
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | F3506 | Reagents |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagents |
Plate buckets | Eppendorf | UL155 | Accessory |
Plate shaker | Fisher | 88-861-023 | Instrument |
PolymorphPrep | PROGEN | 1895 (previous 1114683) | Reagents |
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) | Prestwick Chemical Libraries | Ver19_384 | 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved) |
RPMI 1640 Medium, no phenol red | Gibco | 11-835-030 | Reagents |
Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | Rotor |
ZE5 Cell Analyzer | Bio-Rad Laboratories | Model ZE5 | Instrument |