यह प्रोटोकॉल मानव न्यूट्रोफिल पर β2 इंटीग्रिन सक्रियण को बाधित करने वाली छोटे-अणु दवाओं की पहचान करने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधि का वर्णन करता है।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य β2 इंटीग्रिन सक्रियण के छोटे आणविक विरोधियों की पहचान करने के लिए एक विधि स्थापित करना है, जो विरूपण-परिवर्तन-रिपोर्टिंग एंटीबॉडी और उच्च-थ्रूपुट प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करता है। विधि अन्य एंटीबॉडी-आधारित उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधियों के लिए एक गाइड के रूप में भी काम कर सकती है। β2 इंटीग्रिन ल्यूकोसाइट-विशिष्ट आसंजन अणु हैं जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में महत्वपूर्ण हैं। न्यूट्रोफिल रक्तप्रवाह से बाहर निकलने के लिए इंटीग्रिन सक्रियण पर भरोसा करते हैं, न केवल संक्रमण से लड़ने के लिए बल्कि कई सूजन संबंधी बीमारियों में भी शामिल होने के लिए। β2 इंटीग्रिन सक्रियण को नियंत्रित करना न्यूट्रोफिल से जुड़े भड़काऊ रोगों के इलाज के लिए एक व्यवहार्य दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल में, एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, mAb24, जो विशेष रूप से β2 इंटीग्रिन के उच्च-आत्मीयता हेडपीस से बांधता है, का उपयोग पृथक प्राथमिक मानव न्यूट्रोफिल पर β2 इंटीग्रिन सक्रियण की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। एन-फॉर्माइलमेथियोनिल-ल्यूसिल-फेनिलएलनिन (एफएमएलपी) का उपयोग न्यूट्रोफिल β2 इंटीग्रिन को सक्रिय करने के लिए उत्तेजना के रूप में किया जाता है। इस अध्ययन में स्वचालित रूप से 384-अच्छी तरह से प्लेट नमूने चलाने में सक्षम एक उच्च-थ्रूपुट प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग किया गया था। β2 इंटीग्रिन निषेध पर 320 रसायनों के प्रभाव का मूल्यांकन 3 घंटे के भीतर किया जाता है। अणु जो सीधे β2 इंटीग्रिन को लक्षित करते हैं या जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर-इनसाइड-आउट सक्रियण सिग्नलिंग मार्ग में इंटीग्रिन इनसाइड-आउट एक्टिवेशन सिग्नलिंग मार्ग में अणुओं को लक्षित करते हैं, उन्हें इस दृष्टिकोण के माध्यम से पहचाना जा सकता है।
कई सूजन संबंधी बीमारियों को सूजन या चोट के स्थल पर न्यूट्रोफिल की घुसपैठ की विशेषता है1. इन ऊतकों में घुसपैठ करने के लिए, न्यूट्रोफिल को न्यूट्रोफिल भर्ती कैस्केड को पूरा करना होगा, जिसमें एंडोथेलियम को गिरफ्तारी, पोत की दीवार पर अपव्यय और ऊतक2 में भर्ती करना शामिल है। परिसंचारी न्यूट्रोफिल को इस कैस्केड को पूरा करने के लिए β2 इंटीग्रिन सक्रियण की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से गिरफ्तारी चरण के लिए। इस प्रकार, न्यूट्रोफिल आसंजन, एक्सट्रावेशन और भर्ती को कम करने वाली दवाओं को प्रभावी ढंग से सूजन संबंधी बीमारियों 3,4 का इलाज कर सकते हैं।
β2 इंटीग्रिन को पहले भी भड़काऊ बीमारियों के लिए लक्षित किया गया है। Efalizumab, एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी सीधे इंटीग्रिन αLβ2 को लक्षित करता है, जिसे सोरायसिस5 के इलाज के लिए विकसित किया गया था। हालांकि, इसके घातक दुष्प्रभाव के कारण efalizumab को वापस ले लिया गया था – जेसी वायरसपुनर्सक्रियन 6,7 के परिणामस्वरूप प्रगतिशील मल्टीफोकल ल्यूकोएन्सेफैलोपैथी। नए विरोधी भड़काऊ इंटीग्रिन-आधारित उपचारों को साइड इफेक्ट्स को कम करने के लिए ल्यूकोसाइट्स के संक्रमण-विरोधी कार्यों को बनाए रखने पर विचार करना चाहिए। efalizumab के दुष्प्रभाव रक्तप्रवाह में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लंबे समय तक परिसंचरण के कारण हो सकते हैं, जो लंबी अवधि में प्रतिरक्षा कार्यों को बाधित कर सकता है8. हाल के एक अध्ययन से पता चलता है कि efalizumab αLβ2 क्रॉसलिंकिंग और α4 इंटीग्रिन के अवांछित आंतरिककरण की मध्यस्थता करता है, जो दुष्प्रभावों के लिए एक वैकल्पिक स्पष्टीकरण प्रदान करताहै। इस प्रकार, अल्पकालिक, छोटे-अणु विरोधी इस समस्या से बच सकते हैं।
मानव न्यूट्रोफिल का उपयोग करके छोटे-अणु β2 इंटीग्रिन विरोधी को स्क्रीन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विधि यहां प्रस्तुत की गई है। β2 इंटीग्रिन सक्रियण के लिए इंटीग्रिन एक्टोडोमेन के विरूपण परिवर्तनों की आवश्यकता होती है ताकि इसके लिगैंड तक पहुंच प्राप्त हो सके और इसकी बाध्यकारी आत्मीयता बढ़ सके। विहित स्विचब्लेड मॉडल में, बेंट-क्लोज्ड इंटीग्रिन एक्टोडोमेन पहले एक विस्तारित-बंद रचना तक फैला हुआ है और फिर अपने हेडपीस को पूरी तरह से सक्रिय विस्तारित-खुले रचना10,11,12,13 में खोलता है। एक वैकल्पिक मार्ग भी है जो बेंट-क्लोज्ड से शुरू होकर बेंट-ओपन और एक्सटेंडेड-ओपन तक होता है, अंततः 14,15,16,17,18,19। रचना-विशिष्ट एंटीबॉडी mAb24 मानव β2-I-जैसे डोमेन में एक एपिटोप से बांधता है जब एक्टोडोमेन का हेडपीस20,21,22,23 खुला होता है।
यहां, mAb24-APC का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि β2 इंटीग्रिन सक्रिय हैं या नहीं। न्यूट्रोफिल और इंटीग्रिन को सक्रिय करने के लिए, एन-फॉर्माइलमेथियोनील-ल्यूसिल-फेनिलएलनिन (एफएमएलपी), एक बैक्टीरिया-व्युत्पन्न लघु केमोटैक्टिक पेप्टाइड जो न्यूट्रोफिल β2 इंटीग्रिन24 को सक्रिय कर सकता है, इस प्रोटोकॉल में एक उत्तेजना के रूप में उपयोग किया जाता है। जब fMLP न्यूट्रोफिल पर Fpr1 से बांधता है, तो G-प्रोटीन, फॉस्फोलिपेज़ Cβ, और फॉस्फोइनोसाइटाइड 3-किनेज γ वाले डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कैस्केड सक्रिय होते हैं। इन सिग्नलिंग घटनाओं के परिणामस्वरूप अंततः अंदर-बाहर सिग्नलिंग मार्ग18,25 के माध्यम से इंटीग्रिन सक्रियण होता है। छोटे अणु विरोधी के अलावा जो सीधे β2 इंटीग्रिन से बंधते हैं और इंटीग्रिन सक्रियण26 के संरूपण परिवर्तनों को रोकते हैं, यौगिक जो β2 इंटीग्रिन अंदर-बाहर सक्रियण सिग्नलिंग मार्ग में घटकों को बाधित कर सकते हैं, इस विधि से भी पता लगाया जाएगा। स्वचालित प्रवाह साइटोमीटर उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग को सक्षम करते हैं। नए प्रतिपक्षी की पहचान करना न केवल इंटीग्रिन फिजियोलॉजी की हमारी समझ को गहरा कर सकता है, बल्कि इंटीग्रिन-आधारित एंटी-इंफ्लेमेशन थेरेपी में ट्रांसलेशनल अंतर्दृष्टि भी प्रदान कर सकता है।
न्यूट्रोफिल उत्तेजना और धुंधला की दीक्षा और समाप्ति न्यूट्रोफिल और लगानेवाला पीएफए के अतिरिक्त द्वारा निर्धारित की जाती है। इसलिए, प्रत्येक स्तंभ में न्यूट्रोफिल या पीएफए को पाइप करने के बीच एक ही स…
The authors have nothing to disclose.
हम फ्लो साइटोमेट्री में उनकी सहायता के लिए UConn Health में फ्लो साइटोमेट्री कोर में डॉ. इवान जेलिसन और सुश्री ली झू को धन्यवाद देते हैं, UConn Health में इम्यूनोलॉजी विभाग में डॉ. लिन पुडिंग्टन को उपकरणों के समर्थन के लिए, सुश्री स्लावा गजेवस्का और डॉ. पॉल एपलटन को रक्त के नमूने प्राप्त करने में उनकी मदद के लिए UConn Health में क्लिनिकल रिसर्च कोर में। हम इस पांडुलिपि के वैज्ञानिक लेखन और संपादन में उनकी मदद के लिए UConn स्कूल ऑफ मेडिसिन के डॉ. क्रिस्टोफर “किट” बोनिन और डॉ. जिनेवा हरगिस को स्वीकार करते हैं। इस शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, नेशनल हार्ट, फेफड़े और ब्लड इंस्टीट्यूट (R01HL145454), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज (P20GM121176), यूएसए से अनुदान, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (18CDA34110426) से एक कैरियर डेवलपमेंट अवार्ड और UConn Health से एक स्टार्टअप फंड द्वारा समर्थित किया गया था। चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।
16-channel pipettes | Thermo | 4661090N | Instrument |
384-well plate | Greiner | 784201 | Materials |
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 | BioLegend | 363410 | Reagents |
Bravo Automated Liquid Handling Platform | Agilent | 16050-102 | 384 multi-channel liquid handler |
Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | Instrument |
FlowJo | Becton, Dickinson & Company | NA | Software |
Human Serum Albumin Solution (25%) | GeminiBio | 800-120 | Reagents |
Lifitegrast | Thermofisher | 50-208-2121 | Reagents |
Nexinhib20 | Tocris | 6089 | Reagents |
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | F3506 | Reagents |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagents |
Plate buckets | Eppendorf | UL155 | Accessory |
Plate shaker | Fisher | 88-861-023 | Instrument |
PolymorphPrep | PROGEN | 1895 (previous 1114683) | Reagents |
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) | Prestwick Chemical Libraries | Ver19_384 | 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved) |
RPMI 1640 Medium, no phenol red | Gibco | 11-835-030 | Reagents |
Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | Rotor |
ZE5 Cell Analyzer | Bio-Rad Laboratories | Model ZE5 | Instrument |