מערכת דו-שכבתית של שומנים נתמכת ננו-בר לחקר חלבונים קולטי עקמומיות ממברנה במבחנה

עקמומיות הממברנה היא פרמטר פיזיקלי קריטי של התא המתרחש במגוון תהליכים תאיים כגון מורפוגנזה, חלוקת תאים ונדידת תאים¹. כיום ידוע כי עקמומיות הממברנה היא מעבר לתוצאה פשוטה של אירועים תאיים; במקום זאת, הוא התגלה כרגולטור יעיל של אינטראקציות חלבונים ואיתות תוך-תאי. לדוגמה, מספר חלבונים המעורבים באנדוציטוזה בתיווך קלתרין נמצאו נקשרים באופן מועדף לממברנה המעוקלת, וכתוצאה מכך נוצרה נקודה חמה לאנדוציטוזה². ישנם גורמים רבים ושונים לדפורמציה של הממברנה כגון משיכת ממברנה על ידי כוחות השלד הציטוסקטלי, נוכחות של אסימטריה של שומנים עם קבוצות ראש בגדלים שונים, קיומם של חלבונים טרנסממברניים בעלי צורה חרוטית, הצטברות של חלבונים מעצבי ממברנה כמו חלבוני BAR-domain (הקרויים על שם חלבוני בין, אמפיפיסין ו-Rvs), והחדרת תחום הליקסים האמפיפתיים לממברנה¹ . באופן מעניין, חלבונים ושומנים אלה לא רק מעוותים את הממברנה אלא יכולים גם לחוש את עקמומיות הממברנה ולהפגין הצטברות מועדפת¹. לכן, חיוני לחקור אם וכיצד ממברנות עם עקמומיות שונה משנות את ההתפלגות והדינמיקה של חלבונים ושומנים המחוברים אליהם ואת ההשפעות הפוטנציאליות על התהליכים התוך-תאיים הקשורים אליהם.

טכניקות רבות פותחו כדי לנתח את האינטראקציה בין קרום מעוקל וחלבונים הן בתאים חיים והן במערכות חוץ גופיות. מערכת התאים החיים מספקת סביבת תאים אמיתית עם מגוון שומנים עשיר וויסות איתות חלבוני דינמי 2,3,4,5,6,7. עם זאת, מערכת מתוחכמת כזו קשה לחקור בשל אי הוודאות והתנודות בסביבה התוך תאית. לפיכך, הבדיקות במבחנה באמצעות קרום מלאכותי המורכב ממיני שומנים ידועים וחלבונים מטוהרים הפכו למערכות שחזור חזקות כדי לאפיין את הקשר בין חלבונים לממברנות מעוקלות. באופן מסורתי, ליפוזומים בקטרים שונים נוצרים על ידי שחול כדי לזהות חלבונים רגישים לעקמומיות באמצעות בדיקת שקיעה משותפת באמצעות כוח צנטריפוגלי או בדיקת ציפה משותפת עם שיפוע צפיפות כדי למנוע צבירה של חלבונים ^8,9. עם זאת, העקמומיות של הליפוזומים המובלטים מוגבלת על ידי גודל הנקבוביות הזמין של מסנן הממברנה המשמש במכבש¹⁰. הוכח כי בדיקת עקמומיות ליפוזום יחיד (SLiC) מתגברת על מגבלה זו, שבה ליפוזומים בקטרים שונים מסומנים פלואורסצנטיים ומשותקים על פני השטח, כך שניתן לסמן את העקמומיות על ידי עוצמת הפלואורסצנטיות¹¹. עם זאת, שונות חזקה בהרכב השומנים נצפתה בשלפוחיות קטנות, המשפיעות על דיוק מדידת העקמומיות¹². ניסויים במשיכת קשירה מספקים מדידה מדויקת יותר של העקמומיות על הקשירה החולפת הנמשכת מבועיות חד-לשוניות ענקיות (GUVs) באמצעות פינצטה אופטית, שבה ניתן לשלוט היטב בעקמומיות על ידי מתח הממברנה שנוצר^13,14. שיטה זו מתאימה לחקר חלבונים בעלי חישת עקמומיות חיובית או שלילית, אך היא מוגבלת על ידי התפוקה של דור¹⁰ של הצינורית. בדיקת צינורות ממברנה נתמכים (SMrT) מאפשרת יצירה בו זמנית של צינורות ממברנה מרובים המובלטים מאותו מאגר שומנים על ידי זרימות מיקרופלואידיות. אף על פי כן, עקמומיות הממברנה משתנה באופן מהותי לאורך הננו-צינורית, מה שפוגע בדיוק של מדידת עקמומיות מבוססת פלואורסצנציה^15,16. לשם השוואה, שימוש בשלפוחיות חד-שכבתיות קטנות (SUVs, קוטר <100 ננומטר¹⁷) ליצירת דו-שכבתי של שומנים נתמכים (SLB) על משטחים המכילים טופוגרפיות מתוכננות יצר קרום דו-שכבתי יחיד עם עקמומיות שנקבעה מראש על ידי ננו-פבריקציה או ננו-חומרים בדיוק גבוה^18,19,20.

כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת SLB על משטחי ננו-שבבים מפוברקים עם מערכי ננו-ברים וכיצד ניתן להשתמש בו כדי לחקור את רגישות העקמומיות של חלבונים במבחנה. כפי שניתן לראות באיור 1, ישנם שישה מרכיבים חיוניים של הבדיקה: א) ניקוי והרכבה של השבב עם תא מיקרופלואידי; ב) הכנת רכבי שטח עם הרכב שומנים מוגדר; C) היווצרות SLB על ננו-שבב וקשירה עם חלבונים רגישים לעקמומיות; ד) הדמיה ואפיון של SLB וחלבונים רגישים לעקמומיות תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית; ה) ניקוי השבב לשימוש חוזר; ו) עיבוד תמונה לניתוח כמותי של יכולת חישת עקמומיות חלבון. הפרוטוקול המפורט מתואר שלב אחר שלב להלן.