纳米巴支持的脂质双层系统，用于体外研究膜曲率传感蛋白

膜曲率是细胞的关键物理参数，发生在各种细胞过程中，例如形态发生、细胞分裂和细胞迁移¹.现在人们普遍认为，膜曲率不仅仅是细胞事件的简单结果;相反，它已成为蛋白质相互作用和细胞内信号传导的有效调节剂。例如，发现参与网格蛋白介导的内吞作用的几种蛋白质优先与弯曲膜结合，导致内吞作用²的热点形成。膜变形有许多不同的原因，例如细胞骨架力拉动膜，存在不同大小头基的脂质不对称性，存在锥形跨膜蛋白，膜成形蛋白如BAR结构域蛋白（以Bin，两栖蛋白和Rvs蛋白命名）的积累，以及两亲性螺旋结构域插入膜¹.有趣的是，这些蛋白质和脂质不仅使膜变形，而且还可以感知膜曲率并表现出优先积累^1。因此，研究具有不同曲率的膜是否以及如何改变附着在其上的蛋白质和脂质的分布和动力学以及对相关细胞内过程的潜在影响至关重要。

已经开发了许多技术来分析活细胞和体外系统中弯曲膜和蛋白质之间的相互作用。活细胞系统提供了一个真实的细胞环境，具有丰富的脂质多样性和动态蛋白质信号传导调节²，³，⁴，⁵，^6，7。然而，由于细胞内环境的不确定性和波动性，这种复杂的系统很难研究。因此，使用由已知脂质种类和纯化蛋白质组成的人造膜的体外测定已成为表征蛋白质和弯曲膜之间关系的强大重构系统。传统上，通过挤出产生不同直径的脂质体，以通过使用离心力的共沉降测定或具有密度梯度的共浮选测定来检测曲率敏感的蛋白质，以避免蛋白质聚集^8，9。然而，挤出脂质体的曲率受到挤出机¹⁰中使用的膜过滤器的可用孔径的限制。单脂质体曲率（SLiC）测定已被证明可以克服这一限制，其中不同直径的脂质体被荧光标记并固定在表面上，以便曲率可以用荧光强度¹¹标记。然而，在小囊泡中观察到脂质组成的强烈变化，这影响了曲率测量的准确性¹²。系绳拉动实验使用光学镊子更准确地测量从巨型单层囊泡 （GUV） 拉出的瞬态系绳上的曲率，其中曲率可以通过产生的膜张力很好地控制^13，14。该方法适用于研究正曲率或负曲率传感蛋白，但受到管生成¹⁰的通量的限制。支持的膜管 （SMrT） 测定可同时生成多个膜管，这些膜管通过微流体流从同一脂质储层挤出。然而，膜曲率沿纳米管固有地变化，这损害了基于荧光强度的曲率测量的准确性^15，16。相比之下，使用小的单层囊泡（SUV，直径<100nm¹⁷）在含有设计形貌的表面上形成支持的脂质双层（SLB），产生单个双层膜，其曲率由纳米制造或纳米材料预先确定，精度^为18，^19，20。

在这里，我们提出了一种在具有纳米棒阵列的制造纳米芯片表面上形成SLB的协议，以及如何使用它来探测 体外蛋白质的曲率敏感性。如图 1所示，该测定有六个基本组成部分：A）用微流体室清洁和组装芯片;B）制备具有确定脂质组成的SUV;C）在纳米芯片上形成SLB并与曲率敏感蛋白结合;D）在荧光显微镜下对SLB和曲率敏感蛋白进行成像和表征;e） 清洁芯片以便重复使用;F）用于定量分析蛋白质曲率传感能力的图像处理。下面将逐步介绍详细的协议。