비강 자기조립 나노에멀젼 종양백신의 제조, 특성, 독성 및 효능 평가 In Vitro 및 In Vivo
Summary
여기에서는 비강 자가 조립 나노에멀젼 종양 백신의 시험 관 내 및 생체 내 비강 내 진단 및 평가를 위한 자세한 방법을 제시 합니다.
Abstract
에피토프 펩타이드는 안전성, 높은 특이성 및 편리한 생산으로 인해 종양 백신 분야에서 광범위한 관심을 끌었습니다. 특히, 일부 MHC I-제한 에피토프는 종양 세포를 소거하기 위해 효과적인 세포독성 T 림프구 활성을 유도할 수 있다. 또한, 비강 투여는 편의성과 향상된 환자 순응도로 인해 종양 백신에 대한 효과적이고 안전한 전달 기술입니다. 그러나, 에피토프 펩티드는 이들의 면역원성이 낮고 전달 효율이 부족하기 때문에 비강 전달에 적합하지 않다. 나노 에멀젼 (NE)은 항원을 적재하고 비강 점막 표면으로 직접 전달할 수있는 열역학적으로 안정한 시스템입니다. IKVAV(Ile-Lys-Val-Ala-Val)는 인간 호흡기 상피 세포에서 발현되는 인테그린 결합 펩타이드인 라미닌의 핵심 펜타펩타이드입니다. 본 연구에서는 합성 펩타이드 IKVAV-OVA257-264 (I-OVA )를 함유하는 비강내 자가조립 펩타이드 NE 종양 백신을 저에너지 유화법으로 제조하였다. IKVAV와 OVA257-264 의 조합은 비강 점막 상피 세포에 의한 항원 흡수를 향상시킬 수 있습니다. 여기에서 우리는 투과 전자 현미경 (TEM), 원자력 현미경 (AFM) 및 동적 광 산란 (DLS)에 의한 물리 화학적 특성을 연구하는 프로토콜을 수립합니다. 뮤신 단백질의 존재 하에서의 안정성; BEAS-2B 세포와 C57BL/6 마우스의 비강 및 폐 조직의 세포 생존율을 조사하여 독성; 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)에 의한 세포 흡수; 생체 내에서 작은 동물을 이미징하여 프로파일을 방출합니다. E.G7 종양 보유 모델을 사용하여 백신의 보호 및 치료 효과. 우리는 이 프로토콜이 새로운 T 세포 에피토프 펩타이드 점막 백신의 미래 개발을 위한 기술적, 이론적 단서를 제공할 것으로 기대합니다.
Introduction
가장 중요한 공중 보건 혁신 중 하나인 백신은 전 세계적인 인간 질병 부담과 싸우는 데 핵심적인 역할을 합니다1. 예를 들어, 현재 COVID-19 질병에 대한 120개 이상의 후보 백신이 테스트되고 있으며 그 중 일부는 많은 국가에서 승인되었습니다2. 최근 보고에 따르면 암 백신은 암 환자의 면역체계가 항원을 체내에 이물질로 인식하도록 지시하기 때문에 임상 암 치료의 진행을 효과적으로 개선했다고한다 3. 더욱이, 종양 세포 내부 또는 외부에 위치한 다중 T 세포 에피토프는 펩티드 백신을 설계하는 데 사용될 수 있으며, 이는 방사선 요법 및 화학 요법과 관련된 상당한 독성이 없기 때문에 전이성 암 치료에 이점을 보여주었습니다 4,5. 1990년대 중반 이래로 종양 치료를 위한 전임상 및 임상 시험이 주로 항원 펩티드 백신을 사용하여 수행되었으나 암 환자에게 적절한 치료 효과를 나타내는 백신은 거의 없다6. 또한, 펩타이드 에피토프를 이용한 암 백신은 면역원성이 낮고 전달 효율이 불충분한데, 이는 투여 부위에서 빠르게 확산되는 세포외 펩타이드의 급속한 분해로 인해 면역세포에 의한 항원 흡수가 불충분하기 때문일 수 있다7. 따라서 백신 전달 기술로 이러한 장애물을 극복할 필요가 있다.
융합 단백질로서 발현되는 MHC 클래스 I-결합 257-264 에피토프인 OVA257-264는 빈번하게 사용되는 모델 에피토프8이다. 또한, OVA257-264는 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응에 의존하는 종양에 대한 적응 면역 반응에 결정적이다. OVA257-264 펩타이드에 의해 유도되는 종양의 항원 특이적 CD8+ T 세포에 의해 매개됩니다. 이는 세포독성 T 세포에 의해 방출되는 불충분한 그랜자임 B가 특징이며, 표적 세포의 세포자멸사를 유발한다8. 그러나 유리 OVA257-264 펩티드 투여는 이러한 항원의 흡수가 항원 제시 세포(APC)가 아닌 비특이적 세포에서 발생하기 때문에 CTL 활성을 거의 유도하지 않을 수 있습니다. 적절한 면역 자극의 결핍은 CTL 활성을 초래한다5. 그러므로, 효과적인 CTL 활성의 유도는 상당한 진전을 요구한다.
상피 세포에 의해 제공되는 장벽과 점액의 지속적인 분비로 인해 백신 항원은 비강 점액에서 빠르게 제거됩니다 9,10. 점막 조직을 통과할 수 있는 효율적인 백신 벡터를 개발하는 것은 항원 제시 세포가 점막 상피 아래에 위치하기 때문에 매우 중요합니다9. 백신의 비강 주사는 이론적으로 점막 감염과 싸우기 위해 점막 면역을 유도한다11. 또한, 비강 전달은 편리함, 장내 투여 회피, 환자 순응도 향상 7로 인해 효과적이고 안전한 백신 투여 방법이다. 그러므로, 비강 전달은 신규한 펩타이드 에피토프 나노백신에 대한 좋은 투여 수단이다.
세포-조직 및 세포-세포 상호 작용의 에피토프를 결합하기 위해 여러 합성 생체 재료가 고안되었습니다. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV)과 같은 특정 생리활성 단백질이 하이드로겔 구조의 일부로 도입되어 생체 활성을 부여한다12. 이 펩타이드는 세포 부착, 이동 및 성장에 기여할 가능성이 높으며13 인테그린α 3β1 및 α6β1에 결합하여 다른 암세포 유형과 상호 작용합니다. IKVAV는 라미닌 기저막 단백질α 1 사슬에서 유래한 세포 접착 펩타이드로, 원래 신경 미세 환경을 모델링하고 신경 분화를 유발하는 데 사용되었습니다14. 따라서 이 새로운 백신에 대한 효율적인 전달 수단을 찾는 것이 질병 통제에 중요합니다.
W805EC 및 MF59와 같이 최근에 보고된 에멀젼 시스템도 불활화 인플루엔자 백신 또는 재조합 B형 간염 표면 항원의 비강 전달을 위해 합성되었으며 점막 및 전신 면역을 모두 유발하는 것으로 설명되었다15. 나노에멀젼(NEs)은 미립자 점막 전달 시스템에 비해 투여가 용이하고 효과적인 보조제와의 편리한 공형성의 장점이 있다16. 나노에멀젼 백신은 기존의 탈감작과는 다른 지속적인 방식으로 알레르기 표현형을 변화시켜 장기적인 억제 효과를 가져오는 것으로 보고되었다17. 다른 연구에서는 MTB 특이적 면역우성 항원과 결합된 나노에멀젼이 강력한 점막 세포 반응을 유도하고 상당한 보호를 제공할 수 있다고 보고했다18. 따라서, 합성 펩타이드 IKVAV-OVA257-264(I-OVA ,OVA 257-264에 결합된 IKVAV로 구성된 펩타이드)를 이용한 신규한 비강내 자가조립 나노백신을 설계하였다. 이 새로운 나노백신을 체계적으로 평가하는 것이 중요합니다.
이 프로토콜의 목적은 나노백신의 물리화학적 특성, 독성, 안정성을 체계적으로 평가하고, 기술적 수단을 이용하여 항원 흡수 및 보호 및 치료 효과가 향상되는지 여부를 검출하고, 주요 실험 내용을 정교화하는 것이다. 이 연구에서 우리는 물리화학적 특성과 안정성을 연구하고, CCK-8에 의한 BEAS-2B 세포에 대한 I-OVA NE의 독성 크기를 결정하고, 공초점 현미경을 사용하여 백신에 대한 BEAS-2B 세포의 항원 제시 능력을 관찰하고, 이 새로운 나노백신의 생체 내 및 시험관 내 방출 프로파일을 평가하기 위한 일련의 프로토콜을 수립했습니다, 종양 보유 마우스 모델을 사용하여 E.G7-OVA 백신의 보호 및 치료 효과를 검출합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
면역세포막으로 기능화된 나노백신은 질병 표적 치료에 큰 이점이 있으며, 독특한 종양 친화성, 특정 표적 식별, 순환 연장, 세포간 상호작용 강화, 낮은 전신 독성 등의 특성으로 부작용이 최소화됩니다. 또한 다른 치료 모듈과 쉽게 통합되어 암을 협력적으로 치료할 수 있습니다16,20. 바람직한 속성은 측정, 모양 및 전하와 같은 물리적 및 화학적 특성?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
본 연구는 중국 국가자연과학재단 프로그램 제31670938호, 제32070924 32000651호, 충칭 자연과학재단 프로젝트 프로그램 제2014jcyjA0107호 및 제2019jcyjA-msxmx0159호, 육군 의과대학 특별사업 제2020XBK24호 및 제2020XBK26호, 대학생을 위한 국가혁신 및 기업가정신 프로그램 제202090031021호와 제202090031035호의 지원을 받았다.
Materials
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | Bio-Rad 6.0 | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30088.03 | |
| FITC-labeled I-OVA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | NA | |
| HPLC | Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. | E2695 | |
| Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| IPC-208 | Chong Qing University, China | NA | |
| IVIS system | Caliper Life Science Limited Company | NA | |
| JEM-1230 TEM | JEOL Limited Company of Japan | 1230 TEM | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | NA | |
| MPLA | Invivogen Lit. Co. |
tlrl-mpla | |
| Neomycin Sulfate Ointment | Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. | H31022262 | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30809.01 | |
| Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope | Zeiss, Germany | Zeiss LSM800 |
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