使用 体内 成像筛选哺乳动物宿主活动性感染期间 白色念珠 菌突变菌株的形态发生表型

该方案中的研究已获得爱荷华大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。请参阅CDC指南，了解使用BSL2生物体的设备和程序13。 1. 制备白色念珠菌菌 株 确定用作阳性对照的适当参考菌株。确保该菌株在其谱系和遗传操作方面与实验菌株紧密匹配。注意：对于此处介绍的代表性实验，突变体是由Homann等人14中描述的菌株创建的，这些菌株是由SN152构建的。这些突变体是Arg-。因此，选择的参考菌株是SN250，它也是由SN152创建的，也是Arg-。营养应激源在调节酵母酿酒酵母15的极化生长中至关重要;它们也与白色念珠菌和其他真菌的丝状有关16，17，18。因此，应尽可能将参考菌株的营养与实验菌株相匹配，以避免营养应激的潜在混杂效应。 选择荧光蛋白表达构建体。在筛选各种实验菌株时，创建一个表达一种荧光蛋白的参考菌株，并使用其他荧光蛋白来标记突变菌株。注意：此处提供的代表性数据使用NEON作为参考菌株，iRFP用于突变菌株。任何荧光蛋白都可以使用，如果它高表达，相对明亮，并且能够被所使用的显微镜激发/检测。比较表达不同荧光蛋白的参考菌株的对照实验尚未证明荧光蛋白表达对形态发生有任何影响。 用荧光蛋白表达构建体转化菌株。注意：许多机构要求使用生物安全2级预防措施来处理 白色念珠菌。所有工作都应遵守当地的安全规定。无论当地法规如何，从事 白色念珠菌 工作的调查人员都必须接受安全处理生物体的培训。使用标准乙酸锂方案转换参考和实验菌株19.注意：此处描述的实验使用由Robert Wheeler11，12博士慷慨提供的pENO1-NEON-NATR和pENO1-iRFP-NATR质粒。质粒使用NotI9进行线性化。 根据新苏霉素或其他相关选择培养基的生长情况选择转化体。 识别成功的转化者。使用牙签从每个菌落中挑选一小块细胞，然后将它们混合到显微镜载玻片上的 2.5 μL 水滴中。应用盖玻片并以10x-40x放大倍率检查。使用共聚焦成像系统（用于协议的其余部分）或任何标准宽场荧光显微镜进行检查。适当的转化体将具有具有适当激发和发射波长的明亮信号。注意：对于代表性结果，使用正置荧光显微镜观察NEON表达菌株，该显微镜带有长通滤光片组，带有472/30 nm带通激发滤光片，520/35 nm带通发射滤光片和495 nm单边二向色分束器。由于肉眼看不到iRFP，因此使用用于 体内 成像的共聚焦显微镜系统可视化表达iRFP的菌株，使用638 nm激光激发和检测655-755 nm的发射光。或者，使用荧光立体显微镜、手持式荧光激发系统或通常用于凝胶和蛋白质印迹的荧光检测系统评估宏观菌落荧光。 创建选定转化体的冷冻库存。 在注射前 3 天用表达荧光蛋白的参比和来自冷冻储备的实验菌株接种 YPD（酵母提取物蛋白胨葡萄糖）固体培养基，使用牙签将少量生物从冷冻原液转移到 YPD 固体培养基中。在30°C孵育2天。 对于每种菌株，在注射前 1 天用从几个菌落中提取的 白色念珠菌 细胞接种含有 25 mL YPD 的烧瓶。通过使用牙签将一小块生物体从一个菌落转移到YPD中来做到这一点;重复几次以获得来自几个不同菌落的细胞。在30°C下以175rpm在轨道振荡培养箱中孵育过夜。注意：使用多个菌落作为接种物的来源很重要，因为 白色念珠菌 具有很高的自发遗传改变频率。在开始接种培养时使用多个菌落可最大程度地减少接种物中所有微生物都来自具有显着自发改变的亲本的机会。 注射当天：以500 x g 离心1 mL培养物2分钟 。 用 1 mL 无菌 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （dPBS） 洗涤培养物 3 次。最后一次洗涤后，将沉淀重悬于 1 mL 无菌 dPBS 中。 以1：100稀释洗涤的培养物样品，并使用血细胞计数器计数。 使用dPBS将洗涤培养物的密度调节至1 x 108 个生物/mL。 对于要注射的每组菌株，通过混合等体积的参考菌株和实验菌株来创建接种物。这样可以将接种物的密度保持在每毫升1 x 108 个微生物。注意：每只耳朵可以评估的菌株数量受到用于清晰区分每种荧光蛋白信号的显微镜系统的能力的限制。 制备接种物后，直接进行动物注射。使用前不要储存接种物。 2. 动物制备 获得当地机构动物护理和使用委员会或相关当地管理机构的批准。 从供应商或育种计划获得6-12周龄的小鼠。在接种前，将小鼠安置在它们将在整个实验中生活至少1周的设施中。注意：对于代表性结果，使用6周龄的雌性DBA2 / N小鼠。 接种前至少7天饲喂动物无叶绿素食物。 3. 脱毛和接种 诱导麻醉手术平面（图1）。注意：吸入麻醉剂是有害物质，会引起眼睛或皮肤刺激以及神经系统毒性。必须遵守使用吸入麻醉剂的所有机构政策和程序以及一般实验室安全实践。只有接受过吸入麻醉剂使用培训的个人才能执行这些步骤。标准做法包括戴手套、实验室外套、护目镜、使用麻醉清除系统以及按照机构指南仔细保存记录。将鼠标置于预热的麻醉诱导室中。在整个全身麻醉过程中，将动物保持在温暖的环境中。使用为此目的设计的加热垫和加热的显微镜载物台来实现这一点。请勿使用非处方加热垫，因为它会过热并导致灼伤。 向诱导室提供2%-3%的异氟醚，直到小鼠失去矫正反射并且呼吸缓慢而稳定。清除麻醉的诱导室，并将动物转移到提供1%-2%异氟醚的非再呼吸器鼻锥中。 使用脚趾捏反射或其他验证机制验证麻醉平面。在整个实验过程中，监测动物的呼吸模式和麻醉平面，并根据需要调整麻醉浓度。 涂抹眼部润滑剂以防止角膜干燥。 脱毛（图1C，D）使用棉签将非处方脱毛膏大量涂抹在双耳的内表面和外表面。 2-3分钟后（或按照制造商的说明），用干纱布垫轻轻擦拭耳朵，以去除所有乳霜和头发。用浸有无菌水的纱布垫再擦拭两次，以完全去除脱毛膏残留物。未能去除所有脱毛膏会导致皮肤刺激/炎症。 注射（图1E，F）用浸有70%乙醇的纱布垫擦拭要注射的耳朵表面，然后风干。 通过多次倒置或涡旋将接种物充分混合。 将 20-30 μL 接种物吸入胰岛素注射器中。握住针头朝上，轻轻敲击注射器，以确保桶中的任何空气都在顶部。小心地将空气和多余的接种物喷射回接种管或废液管中，使柱塞处于 10 μL 标记处。 在非惯用手的手指或拇指上戴上顶针，通过将耳朵缠绕在顶针上来稳定耳朵。或者，将非处方双面皮肤胶带（时尚胶带）涂在小圆锥形或圆底塑料管上，然后将耳朵悬在胶带上。这样做时注意不要移开麻醉鼻锥。将鼻锥粘在工作台面上会有所帮助。注意：可以根据研究者的身体舒适度注射耳朵的内侧或外侧。对于显微镜检查，请务必放置鼠标，使注射的耳朵一侧朝向物镜。 保持注射器针头几乎完全平行于皮肤并避免任何大静脉，将针尖插入皮肤的最外层，直到斜面刚好被覆盖。 慢慢皮内注射接种物。良好的皮内注射会在皮肤上产生一个小气泡。将针头固定在原位 15-20 秒，然后再将其从耳朵上取下，以尽量减少泄漏。如果动物耳朵的下侧变湿，则针头太深并完全穿过耳朵。在这种情况下，在耳朵的不同区域重复注射。 用动物的另一只耳朵重复这个过程。这可以用相同的白色念珠菌菌株进行复制，也可以用一组不同的白色念珠菌菌株来完成。 如果不立即成像，请将动物放在加热的恢复室中。观察动物，直到它从麻醉中恢复过来，然后将其放回笼子里。 遵循机构规程，用生物危害标签清楚地标记笼子，并表明笼子里的动物感染了 白色念珠菌。 完成与动物麻醉和任何其他必需的机构实践相关的所有必需记录保存。 使用动物生物安全 2 级预防措施将动物安置在动物设施条件下。 4. 量化 体外 形态发生，与 体内 结果进行比较 使用用于制备接种物的相同洗涤培养物，在RPMI1640 + 10%热灭活胎牛血清中创建1：50稀释的生物体，并在37°C下孵育4小时。或者，可以使用体 外 刺激形态发生的其他培养基。 将样品以 500 x g 离心 5 分钟，然后重悬于 0.5 mL dPBS 中。 以 1：10 的比例稀释样品，将 2.5 μL 稀释的样品放在显微镜载玻片上，并用盖玻片盖住。 使用荧光显微镜检查样品。计数至少100个细胞，记录每种菌株的酵母和丝状细胞的数量。在这里介绍的代表性结果中，丝状细胞被定义为长度超过母细胞长度两倍的任何细胞。注意： 体外 形态发生的定量可以在接种动物的同一天进行。可以在制备注射接种物的同时启动体外 形态发生测定，并在4小时孵育期间进行动物接种。如果所有动物程序在4小时孵育期结束之前完成，则直接检查 体外 刺激细胞。或者，可以将细胞重悬于dPBS中的3.7%甲醛中（在步骤4.2中），并在4°C下储存数天。然后可以在时间允许的情况下对固定生物进行量化。在 体外 定量测定中，不得延迟动物的接种。 5. 体内 成像的准备 准备显微镜（图2A）。打开所有显微镜设备并启动成像软件。如果可用，请加载任何预先确定的成像设置。 激活检测正在使用的荧光蛋白所需的激光器和检测器。 打开加热的显微镜载物台，使其升温至37°C。注意：可以使用带有全封闭环境室的显微镜，而不是加热载物台。 设置一个 z 轴参考点，焦点平面位于盖玻片的顶面。 这可以通过将盖玻片贴在载物台开口上并在盖玻片上放一滴水来完成。 使用较低放大倍率（10倍）的“干”物镜聚焦在水滴的边缘，然后设置z轴参考点。 在将其从载物台上取出之前，使用一条毛巾吸收盖玻片上的水分。 将超长工作距离物镜旋转到位，并在镜头上放置一滴浸没液。放下镜头以避免在放置盖玻片时可能损坏。 将#1.5盖玻片放在载物台开口上并将其粘贴到位。确保胶带完全覆盖盖玻片的所有边缘，以防止盖玻片下方的任何液体吸湿排入显微镜。将物镜升高到z轴参考点，使浸没液与物镜和盖玻片接触。 准备多条压敏胶带，以便在定位鼻锥和鼠标时随时可以使用。 诱导鼠标全身麻醉成像如上（步骤3.1）。 放置鼠标（图2B-D）。将麻醉鼻锥固定在显微镜载物台上，鼻锥的位置，以便在动物就位进行成像时完全覆盖动物的鼻子。这可以通过两名调查员更容易完成。让第一位研究者将麻醉小鼠的鼻子放入鼻锥中，并将鼠标移动到成像位置，同时继续将鼻锥放在动物的鼻子上。让另一位调查员将鼻锥和管子粘到位，使其稳定地位于小鼠的鼻子上。一旦鼻锥被贴到位，在成像过程的剩余时间里将其留在那里。 确定放置鼻锥的最佳位置后，记下其位置。对于随后的成像会议，可以在将动物带到显微镜之前将鼻锥固定在载物台上。 将一滴无菌水滴在物镜上方的盖玻片上。 将鼠标放在显微镜载物台上。确保耳朵在水滴顶部并平放在盖玻片上。 使用第二个（顶部）盖玻片使耳朵变平。将盖玻片的边缘平行于鼠标的身体放置，边缘在耳朵与头部相接的地方接触鼠标。 通过铰链运动将盖玻片的自由边缘降低到显微镜载物台。当盖玻片靠在显微镜载物台上时，它会使耳朵变平。注意不要在耳朵上形成褶皱或脊。 将顶部盖玻片牢固地粘贴到位，使其保持足够的压力以保持耳朵平坦。注意不要在胶带中捕捉到鼠标的头发或胡须。 除非使用带有环境室的显微镜，否则用无菌窗帘松散地覆盖小鼠的身体以保持正常的温环境。 确定感兴趣的字段。确保物镜位于z轴参考点处。 使用白光/宽场成像，将焦点平面调整到耳组织中。一个好的策略是专注于血管 – 如果可以看到红细胞在血管中移动，则焦点平面在组织内。 如果显微镜配备了宽场荧光功能，请使用它来识别感兴趣的区域。如果没有，请使用共聚焦成像。一般来说，使用宽视场显微镜识别感兴趣的区域速度更快，并且需要较少的耳组织照射。使用滤光片立方体检测参比菌株中表达的荧光蛋白，识别具有来自参考菌株的荧光信号的视场。请记住，失焦的光线可能会阻止聚焦在单个生物体上的能力。此步骤的目标是确定共聚焦成像的感兴趣区域。 更改为滤光片立方体，该滤光片立方体将检测实验菌株表达的荧光蛋白并验证它们在所选视野中的存在。 6. 成像 确定设置。当成像软件处于实时共聚焦模式时，当焦平面通过z轴移动时，检查感兴趣的区域。选择一个z轴平面，该平面具有来自所有正在使用的荧光蛋白的强信号。 调整激光功率和/或成像速度以获得足够强的信号，以便可以确定视野中所有细胞的形态。为避免组织损伤，请使用尽可能低的激光功率。注意：与所有成像一样，激光功率、采集速度和分辨率之间存在平衡。确定能够清楚地识别生物形态的设置，同时平衡速度和激光功率，以尽量减少对耳朵组织的照射。由于成像是通过外部真皮进行的，因此激发所需的激光功率高于安装在载玻片上的传统样品的共聚焦成像通常需要的激光功率。幸运的是，形态分析所需的空间分辨率水平并不极端。因此，获得具有足够信号的图像以确定生物体形态而不引起组织损伤是容易实现的。 建立这些参数后，在整个映像会话中使用这些参数，以作为后续映像会话的起点。因此，保存成像设置很有帮助。注意：单个感染区域可能在组织内较浅或较深。更深的区域可能需要增加激光功率。由于该测定依赖于信号的空间分布而不是其强度，因此可以根据需要更改场之间的图像设置。 获取图像。选择一个在参考菌株中具有清晰细丝形成的视野，并且大多数生物体的分布足以确定其形态。 设置 z 堆栈的焦点平面的顶部和底部平面。没有必要覆盖感染区域的整个深度，但请记住，成像体积顶部或底部的生物通常被排除在分析之外。 获取z-stack图像，对每个通道进行伪着色以区分每个菌株，并叠加通道。保存图像。 对其他视野重复此操作。形态发生可能因地点而异;因此，从每只耳朵获取和分析至少三个场很重要。 7.手动二维分析：灯丝频率 使用成像软件将 z 堆栈最大投影到二维图像中。此处提供的说明适用于斐济/图像J。使用 ImageJ 软件打开显微镜图像。 如有必要，对每个通道应用伪颜色，以便直接识别每种 白色念珠菌菌 株。为此，请单击 图像>查找表 > LUT 颜色 并选择所选的伪颜色。 将堆栈文件转换为最大强度投影二维图像：选择 z 堆栈文件。单击图像 >堆叠> Z 投影。 选择顶部和底部平面，然后选择投影类型 “最大强度”。 按菌株类型（通过通道颜色区分）和形态对最大投影图像中看到的每个生物进行计数。明显重叠的生物或生物密度非常高的区域将难以准确计数。从计数中排除这些，但注意不要引入对丝状形式的偏见，丝状形式更有可能重叠。 直接伸入或伸出 z 堆栈的丝状形式将在最大投影中显示为小圆形对象。同样，被图像边界切断的生物可能看起来像酵母，因为细丝不在视野范围内。因此，二维分析总是会高估酵母形式的百分比。由于这将与参考菌株和实验菌株相同，因此请始终将实验结果与参考菌株的结果进行比较。 按照实验设计的要求对结果进行统计比较。 8.手动二维分析：灯丝长度 对于 白色念珠菌，异常的细丝形成可能发生，因为：a）较少的“母”酵母细胞经历形态发生，b）细丝生长速度较慢，或c）丝状生长开始但不维持。为了评估这些可能性，将最大投影图像中每根细丝的曲线路径长度量化为真实三维长度的替代项（如下所述）。当芽在母细胞上发育时，无法判断它是否会变成细丝或酵母。为了确保此分析中仅包括丝状细胞，请仅测量子细胞长度至少是母细胞长度两倍的生物体。 打开在步骤 7 中创建的最大投影图像。 在 ImageJ 工具集中，右键单击 直线/ 分割线工具，然后选择 分割线选项。分段线选项允许用户沿弯曲路径测量细丝长度，考虑到 白色念珠菌 细丝的可塑性，这是必要的。 测量从芽颈到细丝生长端的细丝长度。左键点击芽颈;指针将变为一个小方块。沿其长度描摹细丝，每次长轴出现曲线、转弯或变化时，单击灯丝的中心。双击细丝的生长尖端。 按 控制 + M。这将打开一个弹出窗口，其中列出了面积、平均值、最小值、最大值和长度测量值。测量每根灯丝后，再次按 Control + M 将当前测量值添加到测量表中。 测量完所有细丝后，将长度测量值复制并粘贴到数据分析文件中。 执行统计分析以评估参考菌株和突变菌株中细丝长度的分布。 9. 手动三维分析 为了获得更精确的形态发生测量，以避免高估酵母形式并可能允许区分假菌丝和菌丝，请手动上下滚动 z 堆栈，同时在三维上评估每个生物体的形态。 或者，创建每个z堆栈的三维图像，并在旋转图像时分析每个生物体的形状。 10. 自动分析 使用成像软件，在二维或三维中自动计数生物及其形态。注意：某些用于区分形态类型的算法可能会引入偏差。因此，需要仔细验证与实验设计相关的自动化策略。精心设计和验证的自动图像分析可以提高分析步骤的通量。