Uso de imágenes in vivo para detectar fenotipos de morfogénesis en cepas mutantes de Candida albicans durante la infección activa en un huésped mamífero

Los estudios en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Iowa (IACUC). Consulte las pautas de los CDC para equipos y procedimientos para trabajar con organismos BSL213. 1. Preparación de cepas de Candida albicans Identificar una cepa de referencia apropiada para su uso como control positivo. Asegúrese de que esta cepa coincida estrechamente con las cepas experimentales en términos de su linaje y manipulaciones genéticas.NOTA: Para los experimentos representativos presentados aquí, los mutantes fueron creados a partir de las cepas descritas en Homann, et al.14, que fueron construidas a partir de SN152. Estos mutantes son Arg-. Por lo tanto, la cepa de referencia seleccionada fue SN250, que también se creó a partir de SN152 y también es Arg-. Los factores de estrés nutricional son críticos en la regulación del crecimiento polarizado en la levadura Saccharomyces cerevisiae15; también han sido implicados en la filamentación en C. albicans y otros hongos16,17,18. Por lo tanto, la cepa de referencia debe coincidir para las auxotrofias con las cepas experimentales siempre que sea posible para evitar posibles efectos de confusión del estrés nutricional. Elija construcciones de expresión de proteínas fluorescentes. Al examinar una variedad de cepas experimentales, cree una cepa de referencia que exprese una proteína fluorescente y use otras proteínas fluorescentes para marcar las cepas mutantes.NOTA: Los datos representativos presentados aquí utilizan NEON para la cepa de referencia e iRFP para las cepas mutantes. Cualquier proteína fluorescente se puede utilizar si está altamente expresada, es relativamente brillante y puede ser excitada / detectada por el microscopio que se está utilizando. Los experimentos de control que comparan cepas de referencia que expresan diferentes proteínas fluorescentes no han demostrado ningún impacto de la expresión de proteínas fluorescentes en la morfogénesis. Transformar las cepas con construcciones de expresión de proteínas fluorescentes.NOTA: Muchas instituciones requieren el uso de precauciones de Nivel 2 de Seguridad Biológica para trabajar con C. albicans. Todo el trabajo debe seguir las normas de seguridad locales. Independientemente de las regulaciones locales, los investigadores que trabajan con C. albicans deben estar capacitados en el manejo seguro del organismo.Transformar las cepas de referencia y experimentales utilizando protocolos estándar de acetato de litio19.NOTA: Los experimentos descritos aquí utilizan los plásmidos pENO1-NEON-NAT R y pENO1-iRFP-NATR, generosamente proporcionados por el Dr. Robert Wheeler 11,12. Los plásmidos se linealizaron usando NotI9. Seleccione los transformadores en función del crecimiento en nourseotricina u otro medio de selección relevante. Identificar transformadores exitosos. Elija un pequeño toque de células de cada colonia con un palillo de dientes y luego mézclelas en una gota de agua de 2.5 μL en un portaobjetos de microscopio. Aplique un cubreobjetos y examine con un aumento de 10x-40x. Examine con un sistema de imágenes confocal (utilizado para el resto del protocolo) o cualquier microscopio de fluorescencia de campo amplio estándar. Los transformadores apropiados tendrán una señal brillante con longitudes de onda de excitación y emisión apropiadas.NOTA: Para los resultados representativos, las cepas de expresión NEON se visualizaron utilizando un microscopio de fluorescencia vertical con un conjunto de filtros de paso largo con un filtro de excitación de paso de banda de 472/30 nm, un filtro de emisión de paso de banda de 520/35 nm y un divisor de haz dicroico de borde único de 495 nm. Debido a que iRFP no es visible a simple vista, las cepas de expresión de iRFP se visualizaron utilizando el sistema de microscopía confocal utilizado para imágenes in vivo , utilizando un láser de 638 nm para la excitación y la detección de luz de emisión de 655-755 nm.Alternativamente, evalúe la fluorescencia de colonias macroscópicas utilizando microscopía estereoscópica de fluorescencia, sistemas de excitación de fluorescencia portátiles o sistemas de detección de fluorescencia típicamente utilizados para geles y manchas occidentales. Crear existencias congeladoras de transformadores seleccionados. Inocular medios sólidos YPD (extracto de levadura peptona dextrosa) con una referencia fluorescente que exprese proteínas y cepas experimentales de congeladores 3 días antes de la inyección, utilizando un palillo de dientes para transferir un poco de organismos del material congelador al medio sólido YPD. Incubar a 30 °C durante 2 días. Para cada cepa, inocular un matraz que contenga 25 ml de YPD con células de C. albicans tomadas de varias colonias 1 día antes de la inyección. Haga esto usando un palillo de dientes para transferir un poco de organismos de una colonia al YPD; Repita varias veces para obtener células de varias colonias diferentes. Incubar durante la noche a 30 °C en una incubadora agitadora orbital a 175 rpm.NOTA: Es importante utilizar múltiples colonias como fuente para el inóculo porque C. albicans tiene una alta frecuencia de alteraciones genéticas espontáneas. El uso de múltiples colonias al iniciar el cultivo del inóculo minimiza la posibilidad de que todos los organismos en el inóculo surjan de un padre con alteraciones espontáneas significativas. El día de la inyección:Centrifugar 1 mL del cultivo durante 2 min a 500 x g. Lave el cultivo tres veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (dPBS) estéril de Dulbecco. Después del lavado final, resuspender el pellet en 1 mL de dPBS estéril. Diluir una muestra del cultivo lavado a 1:100 y contar con un hemocitómetro. Ajustar la densidad del cultivo lavado a 1 x 108 organismos por ml usando dPBS. Para cada conjunto de cepas a inyectar, crear el inóculo mezclando volúmenes iguales de la cepa de referencia y de la(s) cepa(s) experimental(es). Esto mantiene la densidad del inóculo en 1 x 108 organismos por ml.NOTA: El número de cepas que se pueden evaluar por oído está limitado por la capacidad del sistema de microscopía utilizado para discriminar claramente la señal de cada proteína fluorescente. Una vez preparado el inóculo, proceda directamente a las inyecciones del animal. No guarde el inóculo antes de usarlo. 2. Preparación animal Obtener la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales local o del órgano de gobierno local correspondiente. Obtenga ratones de 6 a 12 semanas de edad de un proveedor o programa de cría. Alojar ratones en la instalación en la que vivirán durante todo el experimento durante al menos 1 semana antes de la inoculación.NOTA: Para los resultados representativos, se utilizaron ratones hembra DBA2/N de 6 semanas de edad. Alimente a los animales con comida sin clorofila durante al menos 7 días antes de la inoculación. 3. Depilación e inoculación Inducir un plano quirúrgico de anestesia (Figura 1).PRECAUCIÓN: Los agentes anestésicos inhalados son materiales peligrosos y pueden causar irritación de los ojos o la piel, así como toxicidad para el sistema nervioso. Se deben seguir todas las políticas y procedimientos institucionales y las prácticas generales de seguridad de laboratorio para el uso de anestésicos inhalados. Sólo los individuos entrenados en el uso de anestésicos inhalados pueden realizar estos pasos. Las prácticas estándar incluyen el uso de guantes, una bata de laboratorio, protección para los ojos, el uso de un sistema de eliminación de anestesia y el mantenimiento cuidadoso de registros según las pautas institucionales.Coloque un ratón en una cámara de inducción de anestesia precalentada. Mantenga al animal en un ambiente cálido durante la anestesia general. Logre esto usando almohadillas de calentamiento diseñadas para este propósito y una etapa de microscopio calentado. No use una almohadilla térmica de venta libre, ya que puede sobrecalentarse y causar quemaduras. Proporcione 2% -3% de isoflurano a la cámara de inducción hasta que el ratón haya perdido su reflejo de enderezamiento y las respiraciones sean lentas y constantes. Purgar la cámara de inducción de la anestesia y transferir al animal a un cono nasal sin rebreather que proporcione 1% -2% de isoflurano. Validar el plano de anestesia utilizando el reflejo de pellizco del dedo del pie u otros mecanismos de verificación. A lo largo del experimento, monitoree el patrón respiratorio y el plano anestésico del animal, y ajuste la concentración anestésica según sea necesario. Aplique lubricante ocular para prevenir la desecación corneal. Depilación (Figura 1C,D)Aplique una crema depilatoria de venta libre generosamente en la superficie interna y externa de ambas orejas con un hisopo con punta de algodón. Después de 2-3 minutos (o según las instrucciones del fabricante), limpie suavemente la oreja con una gasa seca para eliminar toda la crema y el vello. Limpie dos veces más con gasas saturadas en agua estéril para eliminar completamente los residuos de crema depilatoria. Si no se retira toda la crema depilatoria, se producirá irritación / inflamación de la piel. Inyección (Figura 1E, F)Limpie la superficie de la oreja para inyectarla con una gasa saturada en etanol al 70% y deje secar al aire. Mezclar bien el inóculo invirtiendo varias veces o vórtice. Extraiga 20-30 μL de inóculo en una jeringa de insulina. Sosteniendo la aguja apuntando hacia arriba, golpee suavemente la jeringa para asegurarse de que el aire en el barril esté en la parte superior. Expulse cuidadosamente el aire y el exceso de inóculo de nuevo en el tubo de inóculo o en un tubo de descarga para que el émbolo esté en la marca de 10 μL. Usando un dedal en un dedo o pulgar de la mano no dominante, estabilice la oreja envolviéndola a través del dedal. Alternativamente, aplique cinta adhesiva de doble cara de venta libre (cinta de moda) a un pequeño tubo de plástico cónico o de fondo redondo y coloque la oreja sobre la cinta. Tenga cuidado de no desalojar el cono nasal de anestesia mientras hace esto. Puede ser útil pegar la nariz a la superficie de trabajo.NOTA: Se puede inyectar el lado interno o externo del oído según la comodidad física del investigador. Para la microscopía, asegúrese de colocar el mouse de manera que el lado de la oreja inyectada esté orientado hacia la lente del objetivo. Manteniendo la aguja de la jeringa casi completamente paralela a la piel y evitando las venas grandes, inserte la punta de la aguja en la capa más externa de la piel hasta que el bisel esté cubierto. Inyecte lentamente el inóculo por vía intradérmica. Una buena inyección intradérmica levantará una pequeña burbuja en la piel. Mantenga la aguja en su lugar durante 15-20 s antes de retirarla de la oreja para minimizar las fugas.Si la parte inferior de la oreja del animal se humedece, la aguja era demasiado profunda y pasaba por la oreja por completo. En ese caso, repita la inyección en un área diferente del oído. Repita el proceso usando la otra oreja del animal. Esto se puede hacer con las mismas cepas de C. albicans para una réplica o con un conjunto diferente de cepas de C. albicans. Si no se obtienen imágenes de inmediato, coloque al animal en una cámara de recuperación calentada. Observe al animal hasta que se haya recuperado de la anestesia y luego devuélvalo a su jaula de alojamiento. Siguiendo los protocolos institucionales, marque claramente la jaula con etiquetas de riesgo biológico e indique que los animales en la jaula están infectados con Candida albicans. Completar todos los registros requeridos relacionados con la anestesia animal y cualquier otra práctica institucional requerida. Aloje al animal en condiciones de instalaciones para animales utilizando las precauciones de Nivel 2 de Seguridad Biológica Animal. 4. Cuantificar la morfogénesis in vitro para compararla con los resultados in vivo Utilizando los mismos cultivos lavados que se utilizaron para preparar el inóculo, crear una dilución 1:50 de organismos en RPMI1640 + 10% de suero bovino fetal inactivado por calor e incubar a 37 °C con volteo durante 4 h. Alternativamente, se pueden utilizar otros medios que estimulan la morfogénesis in vitro . Centrifugar la muestra durante 5 min a 500 x g y resuspender en 0,5 mL de dPBS. Diluir la muestra en una proporción de 1:10, colocar 2,5 μL de la muestra diluida en un portaobjetos de microscopio y cubrirla con un cubreobjetos. Examine la muestra con un microscopio de fluorescencia. Contar al menos 100 células, registrando el número de levaduras y células filamentosas para cada cepa. En los resultados representativos presentados aquí, una célula filamentosa se define como cualquier célula con una longitud de más del doble de la longitud de la célula madre.NOTA: La cuantificación de la morfogénesis in vitro puede realizarse el mismo día de la inoculación de los animales. Es posible iniciar el ensayo de morfogénesis in vitro mientras se prepara el inóculo para inyección y realizar la inoculación de los animales durante el período de incubación de 4 h. Si todos los procedimientos con animales se completan antes del final del período de incubación de 4 h, proceda directamente al examen de las células estimuladas in vitro . Alternativamente, las células pueden resuspenderse en formaldehído al 3,7% en dPBS (en el paso 4.2) y almacenarse a 4 °C durante varios días. Los organismos fijos se pueden cuantificar según lo permita el tiempo. La inoculación de los animales no deberá retrasarse para el ensayo de cuantificación in vitro . 5. Preparación para imágenes in vivo Prepare el microscopio (Figura 2A).Encienda todo el equipo de microscopía e inicie el software de imágenes.Si está disponible, cargue cualquier configuración de imagen predeterminada. Active los láseres y detectores necesarios para detectar las proteínas fluorescentes que se utilizan. Encienda la platina del microscopio calentado y deje que se caliente a 37 °C.NOTA: Es posible utilizar un microscopio con una cámara ambiental completamente cerrada en lugar de una etapa calentada. Establezca un punto de referencia del eje z con el plano de enfoque situado en la superficie superior del cubreobjetos.  Esto se puede hacer pegando un cubreobjetos en su lugar sobre la abertura del escenario y poniendo una gota de agua en el cubreobjetos.  Utilice un objetivo “seco” de menor aumento (10x) para enfocar el borde de la gota de agua y luego establezca el punto de referencia del eje z.  Use un trozo de toallita para absorber el agua del cubreobjetos antes de retirarlo del escenario. Gire el objetivo de distancia de trabajo muy larga en su lugar y coloque una gota de líquido de inmersión en la lente. Baje la lente para evitar posibles daños al colocar el cubreobjetos. Coloque un cubreobjetos # 1.5 sobre la abertura del escenario y péguelo en su lugar. Asegúrese de que la cinta cubra completamente todos los bordes del cubreobjetos para evitar que cualquier fluido penetre debajo del cubreobjetos en el microscopio. Eleve el objetivo hasta el punto de referencia del eje z para que el fluido de inmersión esté en contacto tanto con la lente del objetivo como con el cubreobjetos. Prepare varias piezas de cinta sensible a la presión para que estén listas para usar al colocar la nariz y el mouse. Inducir anestesia general en el ratón para obtener imágenes como se indica arriba (paso 3.1). Coloque el ratón (Figura 2B-D).Asegure un cono nasal de anestesia en la etapa del microscopio con la nariz colocada de modo que cubra completamente la nariz del animal cuando el animal esté en posición para obtener imágenes. Esto se puede lograr más fácilmente con dos investigadores. Haga que el primer investigador coloque la nariz del ratón anestesiado en la nariz y mueva al ratón a su posición para obtener imágenes mientras continúa sosteniendo la nariz sobre la nariz del animal. Haga que el otro investigador pegue la nariz y el tubo en su lugar para que se asiente de manera estable sobre la nariz del ratón. Una vez que la nariz esté pegada en su lugar, déjela allí durante el resto de la sesión de imágenes. Después de establecer el mejor lugar para colocar la nariz, observe su posición. Para sesiones de imágenes posteriores, la nariz se puede asegurar a la etapa antes de llevar a un animal al microscopio. Coloque una gota de agua estéril en el cubreobjetos sobre la lente del objetivo. Coloque el ratón en la platina del microscopio. Asegúrese de que la oreja esté encima de la gota de agua y plana contra el cubreobjetos. Use un segundo cubreobjetos (superior) para aplanar la oreja.Coloque el borde del cubreobjetos paralelo al cuerpo del ratón, con el borde tocando el ratón donde la oreja se encuentra con la cabeza. Baje el borde libre del cubreobjetos a la etapa del microscopio con un movimiento de bisagra. A medida que el cubreobjetos viene contra la etapa del microscopio, aplanará la oreja. Tenga cuidado de no crear pliegues o crestas en la oreja. Pegue el cubreobjetos superior en su lugar de forma segura para que mantenga la presión suficiente para mantener la oreja plana. Tenga cuidado de no atrapar el pelo o los bigotes del ratón en la cinta. A menos que se use un microscopio con una cámara ambiental, cubra holgadamente el cuerpo del ratón con una cortina estéril para mantener un ambiente normotérmico. Identificar un campo de interés.Asegúrese de que el objetivo está en el punto de referencia del eje z. Con imágenes de luz blanca/campo amplio, ajuste el plano de enfoque en el tejido del oído. Una buena estrategia es centrarse en los vasos sanguíneos: si uno puede ver los glóbulos rojos moviéndose en los vasos sanguíneos, el plano de enfoque está dentro del tejido. Si el microscopio está equipado con capacidad de fluorescencia de campo amplio, utilícelo para identificar un campo de interés. Si no es así, use imágenes confocales. En general, el uso de microscopía de campo amplio para identificar áreas de interés es más rápido y requiere menos irradiación del tejido del oído.Usando un cubo de filtro para la detección de la proteína fluorescente expresada en la cepa de referencia, identifique un campo de visión que tenga una señal fluorescente de la cepa de referencia. Tenga en cuenta que la luz desenfocada probablemente evitará la capacidad de enfocar organismos individuales. El objetivo de este paso es identificar un área de interés para las imágenes confocales. Cambie a un cubo de filtro que detectará la proteína fluorescente expresada por la(s) cepa(s) experimental(es) y verificará su presencia en el campo de visión seleccionado. 6. Imágenes Determine la configuración.Mientras el software de imágenes está en modo confocal en vivo, examine el campo de interés a medida que el plano focal se mueve a través del eje z. Elija un plano del eje z con una señal fuerte de todas las proteínas fluorescentes que se utilizan. Ajuste la potencia del láser y/o la velocidad de imagen para obtener una señal lo suficientemente fuerte como para que se pueda determinar la morfología de todas las células en el campo de visión. Para evitar daños en los tejidos, utilice la menor potencia láser posible.NOTA: Al igual que con todas las imágenes, existe un equilibrio entre la potencia del láser, la velocidad de adquisición y la resolución. Identifique los ajustes que identifican claramente la morfología del organismo mientras equilibra la velocidad y la potencia del láser para minimizar la irradiación del tejido del oído. Debido a que las imágenes se producen a través de la dermis externa, se requiere una mayor potencia láser para la excitación de lo que normalmente es necesario para las imágenes confocales de muestras tradicionales montadas en portaobjetos. Afortunadamente, el nivel de resolución espacial requerido para el análisis de la morfología no es extremo. Por lo tanto, la obtención de imágenes con una señal suficiente para determinar la morfología del organismo sin causar daño tisular es fácilmente alcanzable. Una vez establecidos estos parámetros, utilícelos durante toda la sesión de imágenes para que sirvan como punto de partida para las sesiones de imágenes posteriores. Por lo tanto, es útil guardar la configuración de imágenes.NOTA: Las áreas individuales de infección pueden ser menos profundas o más profundas dentro del tejido. Las áreas más profundas pueden requerir un aumento en la potencia del láser. Debido a que este ensayo se basa en la distribución espacial de la señal en lugar de su intensidad, es aceptable cambiar la configuración de imagen entre campos según sea necesario. Obtén las imágenes.Elija un campo de visión que tenga una clara formación de filamentos en la cepa de referencia y donde la mayoría de los organismos estén lo suficientemente dispersos como para que se pueda determinar su morfología. Establezca los planos superior e inferior de enfoque para una pila z. No es necesario cubrir toda la profundidad del área infectada, pero tenga en cuenta que los organismos en la parte superior o inferior del volumen de la imagen generalmente se excluyen del análisis. Adquiera imágenes z-stack, pseudo color cada canal para distinguir cada cepa, y superponer los canales. Guarde las imágenes. Repita para otros campos de visión. La morfogénesis puede variar de un lugar a otro; Por lo tanto, adquirir y analizar al menos tres campos de cada oído es importante. 7. Análisis bidimensional manual: frecuencia de filamentación Utilice software de imágenes para realizar una proyección máxima de la pila z en una imagen bidimensional. Las instrucciones proporcionadas aquí son para FIJI/Imagen J.Abra imágenes de microscopía utilizando el software ImageJ. Si es necesario, aplique un pseudocolor a cada canal para permitir la identificación directa de cada cepa de C. albicans. Para ello, haga clic en Imagen > Tabla de búsqueda > LUT Color y seleccione el pseudocolor elegido. Convierta el archivo de pila en una imagen bidimensional de proyección de intensidad máxima:Seleccione el archivo z-stack. Haga clic en la imagen > pilas > proyección Z. Seleccione el plano superior e inferior y seleccione el tipo de proyección Intensidad máxima. Cuente cada organismo visto en las imágenes de proyección máxima por tipo de cepa (distinguida por el color del canal) y morfología.Los organismos que se superponen significativamente o las áreas con una densidad de organismos muy alta serán difíciles de contar con precisión. Excluya estos del conteo, pero tenga cuidado de no introducir sesgos contra las formas filamentosas, que tienen más probabilidades de superponerse. Las formas filamentosas que se proyectan directamente dentro o fuera de la pila z aparecerán como pequeños objetos redondos en una proyección máxima. Del mismo modo, los organismos que están cortados por el borde de la imagen pueden parecer levadura porque el filamento está fuera del campo de visión. Por lo tanto, el análisis bidimensional siempre sobreestimará el porcentaje de formas de levadura. Como esto ocurrirá por igual con la(s) cepa(s) de referencia y experimental(es), siempre compare los resultados experimentales con los de una cepa de referencia. Realizar comparaciones estadísticas de los resultados según lo dictado por el diseño experimental. 8. Análisis bidimensional manual: longitud del filamento Para C. albicans, la formación aberrante de filamentos puede ocurrir porque: a) menos células de levadura “madre” experimentan morfogénesis, b) los filamentos crecen a un ritmo más lento, o c) el crecimiento filamentoso se inicia pero no se mantiene. Para evaluar estas posibilidades, cuantifique la longitud de la trayectoria de la curva de cada filamento en la imagen de proyección máxima como sustituto de la verdadera longitud tridimensional (discutida a continuación).Cuando un brote se está desarrollando en una célula madre, no es posible saber si se convertirá en un filamento o una levadura. Para asegurarse de que solo se incluyan células filamentosas en este análisis, mida solo los organismos en los que la célula hija tenga al menos el doble de la longitud de la célula madre. Abra la imagen de proyección máxima creada en el paso 7. En el conjunto de herramientas ImageJ, haga clic con el botón derecho en la herramienta Línea recta/segmentada y elija la opción Línea segmentada. La opción de línea segmentada permite al usuario medir la longitud del filamento a lo largo de una trayectoria curva, una necesidad dada la plasticidad de los filamentos de C. albicans. Mide la longitud del filamento desde el cuello del cogollo hasta el extremo de crecimiento del filamento. Haga clic izquierdo en el cuello del brote; El puntero cambiará a un cuadrado pequeño. Traza el filamento a lo largo de su longitud, haciendo clic en el centro del filamento cada vez que haya una curva, giro o cambio del eje largo del filamento. Haga doble clic en la punta de crecimiento del filamento. Presione Control + M. Esto abrirá una ventana emergente que tabula las mediciones de Área, Media, Mín., Máx. y Longitud. Después de medir cada filamento, presione Control + M nuevamente para agregar la medición actual a la tabla de medidas. Cuando se hayan medido todos los filamentos, copie y pegue las medidas de longitud en un archivo de análisis de datos. Realizar análisis estadísticos para evaluar la distribución de longitudes de filamento en la cepa de referencia y la cepa mutante. 9. Análisis tridimensional manual Para obtener una medición más precisa de la morfogénesis que evite la sobreestimación de las formas de levadura y pueda permitir la discriminación entre pseudohifas e hifas, desplácese manualmente hacia arriba y hacia abajo a través de la pila z mientras evalúa la morfología de cada organismo en tres dimensiones. Alternativamente, cree una imagen tridimensional de cada pila z y analice la forma de cada organismo mientras gira la imagen. 10. Análisis automatizado Utilizando el software de imágenes, automatice la enumeración de organismos y su morfología en dos o tres dimensiones.NOTA: Algunos algoritmos para la discriminación de tipos de morfología pueden introducir sesgos. Por lo tanto, las estrategias de automatización deben validarse cuidadosamente en relación con el diseño experimental. El análisis automatizado de imágenes bien diseñado y validado puede aumentar el rendimiento del paso de análisis.