Kranialfönster har blivit allestädes närvarande inom neurovetenskap, neuralteknik och biologi för att möjliggöra direkt visualisering och avbildning av cortex hos levande djur 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Den kraftfulla kombinationen av transgena möss och multifotonavbildning har gett extremt värdefulla insikter i kretsaktivitet och andra biologiska insikter i in vivo-hjärnan 12,13,14,15,16,17,18. Miniatyrmikroskop monterade på skallen har ytterligare utökat dessa möjligheter för att möjliggöra inspelningar i vakna, fritt rörliga djur¹⁹. Processen att skapa ett kranialfönster kräver kraftborrning för att tunna eller helt ta bort kranialbenet för att producera tillräckligt stora kraniotomier för att säkra en transparent glasbit över cortex²⁰. Polydimetylsiloxan (PDMS) och andra polymerer har också testats som kranialfönstermaterial ^9,21. I slutändan är det ideala kranialfönstret ett som inte förändrar eller stör normal endogen aktivitet under. Det är emellertid allmänt accepterat att kranial fönsterborrning förvärrar underliggande vävnad, vilket leder till skador på hjärnan, störningar i miljön och påverkar hjärnhinnorna till den grad att multifotonbilddjupet²² tillsluts. Den resulterande neuroinflammationen har ett brett spektrum av effekter som sträcker sig från permeabilitet av blod-hjärnbarriären (BBB), till aktivering och rekrytering av gliaceller runt implantatstället²³. Därför är det avgörande att karakterisera säkrare och mer reproducerbara metoder för borrning av kranialfönster för att uppnå konsekvent bildkvalitet och minska störfaktorer.

Medan försiktighet vidtas för att minimera trauma mot den underliggande vävnaden, har borrningen av benet potential att orsaka både termiska och mekaniska störningar i hjärnan^24,25. Mekaniskt trauma från oavsiktlig borrpenetration i dura kan ytterligare inducera varierande grader av kortikal skada²⁴. I en studie av Shoffstall et al.25 resulterade värmen från benborrning i en ökad BBB-permeabilitet, vilket indikeras av närvaron av Evans Blue (EB) färgämne i hjärnparenkymet²⁵. EB-färgämne, injicerat intravenöst, binder till cirkulerande albumin i blodomloppet och passerar därför normalt inte en hälsosam BBB i märkbara koncentrationer. Som ett resultat används EB-färgämne vanligtvis som en känslig markör för BBB-permeabilitet^26,27. Medan deras studie inte direkt mätte effekten av BBB-permeabiliteten på efterföljande biologiska följder som studerades, har tidigare studier korrelerat BBB-permeabilitet till ett ökat neuroinflammatoriskt svar på kroniskt implanterade mikroelektroder och förändringar i motorisk funktion²⁸.

Beroende på studiens mål kan storleken på termisk och mekanisk skada bidra till en källa till experimentellt fel, vilket negativt påverkar studiens rigor och reproducerbarhet. Det finns dussintals citerade metoder för att producera kranialfönster, var och en med olika borrutrustning, hastigheter, tekniker och användare 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et al.25 rapporterade att den observerade variationen i uppvärmningsresultaten tillskrevs variabilitet i borrens applicerade kraft, matningshastighet och appliceringsvinkel, bland andra aspekter som inte kan kontrolleras vid borrning för hand ²⁵. Det finns en tro på att automatiserade borrsystem och annan stereotaxisk utrustning kan förbättra reproducerbarheten och resultatkonsistensen, men publicerade metodstudier har inte noggrant utvärderat temperatur eller BBB-permeabilitet som ett av resultaten. Därför finns det ett behov av mer reproducerbara och konsekvent tillämpade metoder för att producera kranialfönster, liksom metoder som tillämpas noggrant för att bedöma effekterna av kranial fönsterborrning på underliggande nervvävnad.

Fokus för denna studie är att bestämma och utveckla konsekventa och säkra borrmetoder för kranialfönster. Storleken på kraniotomin för kranialfönsterinstallation är betydligt större än vanliga kraniotomier för hjärnimplanterade mikroelektroder. Sådana kraniotomier kan inte kompletteras med ett enda borrhål vid användning av standardutrustning, vilket introducerar mer interkirurgisk teknikvariation när den utförs för hand²⁰. Kirurgiska borrrobotar har introducerats på fältet, men har inte antagits allmänt ^1,6,29. Automatisering av borrning ger kontroll över variabler som bidrar till observerad variation från försök till försök, vilket tyder på att användning av utrustningen kan minska inter- och intrakirurgeffekter. Detta är av särskilt intresse med tanke på den extra svårigheten med den större kraniotomi som behövs för kranialfönsterplacering. Även om man kan anta att det finns tydliga fördelar med styrningen som tillhandahålls genom att automatisera borrningen, har det gjorts lite bedömning av implementeringen av denna utrustning. Även om synliga lesioner inte har observerats⁵, är det högre känslighetstestet med EB önskvärt.

Här mäts BBB-permeabiliteten med hjälp av en kommersiellt tillgänglig kirurgisk borrrobot med motsvarande programvara, som möjliggör programmering av stereotaktiska koordinater, kraniotomiplanering/kartläggning och ett urval av borrstilar (“punkt-för-punkt” vs “horisontell”), med hänvisning till borrkronans dirigerade väg. Ursprungligen borras åtta “frö” -punkter (figur 1A), som beskriver kranialfönstret. Härifrån skärs utrymmet mellan fröna ut med antingen “punkt-för-punkt” eller “horisontell” borrmetod. “Punkt-för-punkt” utför vertikala pilothålskärningar (liknar en CNC-borrpress), medan “horisontell” utför horisontella snitt längs kranialfönstrets omkrets som skisserar hålet (liknar en CNC-router). Resultatet för båda metoderna är en bit skalle som kan tas bort för att avslöja kranialfönstret. För att isolera skador från borrning avlägsnas inte kranialfönstret fysiskt för att undvika ytterligare skador. En kombination av EB-färgämne i kombination med fluorescerande avbildning används för att mäta BBB-permeabilitet efter att ha utfört kraniotomier hos möss, och ett infogat termoelement används för att direkt mäta temperaturen på hjärnytan under borrning (figur 1B, C). Tidigare observationer indikerade att pulsad borrning på/av med 2 s intervall var tillräckligt för att minska borruppvärmningen²⁵, och ingår därför i den experimentella metoden för den kirurgiska roboten.

Syftet med det presenterade arbetet är att demonstrera metoder för att bedöma termiska skador från kraniotomiborrning. Medan metoderna presenteras i samband med automatiserad borrning kan sådana metoder också tillämpas på manuella borrscheman. Dessa metoder kan användas för att validera användningen av utrustning och/eller borrscheman innan de antas som standardförfarande.

Figur 1: Schematisk experimentell rörledning. Schematisk demonstration av processen djur genomgick för EB-kvantifiering efter kraniell fönsterprocedur. (A) Schematisk inställning av musen med stereotaxisk ram och kirurgisk robotborr. Ett exempel på kranialfönster visas över motorcortex med fröpunkter (grön) och kantpunkter (blå). (B) Perfusionsinställningen inkluderar injektion av 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i hela djuret för att avlägsna blod, följt av extraktion av hjärnan. (C) Hjärnan placeras sedan i EB fluorescerande bildsystemkammare för att utföra fluorescerande avbildning på Evans Blue-färgämnet. Klicka här för att se en större version av denna figur.