Измерение роста скелетных мышц в реальном времени у отдельных живых рыбок данио, подвергшихся измененной электрической активности
Summary
Оптическая прозрачность является основным преимуществом для биологической и физиологической работы клеток у рыбок данио. Описаны надежные методы измерения роста клеток у отдельных животных, которые позволяют по-новому взглянуть на то, как рост скелетных мышц и соседних тканей интегрирован с ростом всего тела.
Abstract
Ряд методов может быть использован для визуализации отдельных клеток по всему телу живых эмбриональных, личиночных или молодых рыбок данио. Показано, что живые рыбы с флуоресцентно-маркированными плазматическими мембранами могут быть отсканированы в конфокальном лазерном сканирующем микроскопе с целью определения объема мышечной ткани и количества присутствующих мышечных волокон. Эффективные подходы к измерению количества и размера клеток у живых животных с течением времени описываются и проверяются с помощью более сложных методов сегментации. Описаны методы, позволяющие контролировать электрическую и, следовательно, сократительную активность мышц. Потеря сократительной активности скелетных мышц значительно снижает рост мышц. У личинок описан протокол, позволяющий повторно вводить узорчатую электрическую сократительную активность. Описанные методы минимизируют влияние межиндивидуальной изменчивости и позволят проанализировать влияние электрических, генетических, лекарственных или экологических стимулов на различные клеточные и физиологические параметры роста в контексте живого организма. Впоследствии может быть выполнено долгосрочное наблюдение за измеренными эффектами определенного вмешательства в раннем возрасте на людей.
Introduction
Регулируемый рост тканей, включающий увеличение количества клеток (гиперплазия) и / или размера клеток (гипертрофия), является решающим фактором развития, регенерации и экологической и эволюционной адаптации. Несмотря на огромные успехи в молекулярно-генетическом понимании как клеточной биологии, так и биологии развития за последние десятилетия, механистическое понимание регуляции размера тканей и органов все еще находится в зачаточном состоянии. Одной из причин этого пробела в знаниях является сложность количественной оценки роста тканей в живых организмах с необходимой пространственной и временной точностью.
Различные аспекты роста целых организмов могут быть измерены многократно с течением времени, выявляя кривые роста для каждого отдельного 1,2,3,4,5. Все более сложные методы сканирования, такие как двойная рентгеновская абсорбциометрия (DXA), компьютерная томография (КТ) и магнитно-резонансная томография (МРТ), позволяют отслеживать рост целых органов и других областей тела (например, отдельных идентифицированных скелетных мышц) у отдельных людей, как человека, так и в модельных организмах 6,7,8,9,10 . Тем не менее, эти методы еще не имеют разрешения для выявления отдельных клеток, и, таким образом, связи между клеточным поведением и ростом на уровне тканей было трудно различить. Чтобы установить такие связи, традиционные исследования часто опирались на когорты похожих отдельных животных, некоторые из которых приносятся в жертву в последовательные моменты времени, а затем анализируются в цитологических деталях. Такие подходы требуют усреднения наблюдаемых изменений по группам (предпочтительно похожих, но, тем не менее, переменных) людей и, таким образом, страдают от отсутствия временного и пространственного разрешения, что затрудняет поиск коррелированных событий на клеточном уровне, наводящих на мысль о причине и следствии.
Исследования на модельных организмах беспозвоночных, первоначально у C. elegans и D. melanogaster, обошли эти проблемы, разработав оптическую микроскопию для достижения клеточного разрешения и точного измерения роста с течением времени у отдельных особей. Такие исследования выявили поразительно инвариантное поведение клеточной линии в росте этих небольших модельных организмов 11,12,13,14,15,16,17. Тем не менее, многие животные, включая всех позвоночных, имеют неопределенные клеточные линии и контролируют рост тканей с помощью таинственных процессов обратной связи, которые служат для превращения генетически закодированной программы роста в функциональный трехмерный организм со всеми составляющими его тканями и органами, соответствующим образом подобранными по размеру. Чтобы понять эти сложные процессы роста, желательно изобразить целые ткани или органы с течением времени у отдельных людей, которыми можно экспериментально манипулировать с помощью генетических, фармакологических или других вмешательств в выбранное время и последующего анализа эффекта.
Каждая скелетная мышца позвонка имеет определенный размер, форму и функцию, а также хорошо охарактеризованные взаимодействия с соседними тканями, такими как кости, сухожилия и нервы. Некоторые мышцы маленькие, лежат прямо под кожей и поэтому являются хорошими кандидатами для исследований с высоким разрешением. Подобно большинству органов, каждая мышца растет на протяжении всей эмбриональной, постнатальной и ювенильной жизни, прежде чем достичь стабильного взрослого размера. Мышцы, однако, также обладают уникальной способностью изменять размер во взрослой жизни, в зависимости от использования и питания18, и это свойство оказывает серьезное влияние на физическую форму организма, спортивные результаты и независимую жизнь. Потеря мышечной массы и функции в пожилом возрасте, саркопения, является проблемой растущей обеспокоенности для обществ, сталкивающихся со старением населения 19,20,21.
Мы и другие сосредоточились на росте определенных блоков скелетной мышечной ткани в сегментно-повторяющемся теле личинок рыбок данио, как внешне замкнутой системы, содержащей несколько сотен клеток, в которых можно наблюдать рост, поддержание и восстановлениетканей и манипулировать 22,23,24,25,26. В то время как ранее сообщалось онекоторых количественных работах 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, нет подробного и проверенного метода измерения роста мышц в клеточных деталях у отдельных организмов позвоночных с течением времени. Здесь описан эффективный протокол выполнения таких повторных измерений наряду с валидацией и приведен пример его использования для анализа изменений как гипертрофического, так и гиперпластического роста в ответ на измененную электрическую активность.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы сообщаем о методе точной и эффективной оценки мышечного объема живых личинок рыбок данио на стадиях или в генетических вариантах, в которых пигментация не является большим препятствием для визуализации и когда транзиторная анестезия и / или иммобилизация хорошо переносятся. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы глубоко обязаны усилиям членов лаборатории Хьюза докторов Ситарамайи Аттили, Яны Кот, Фернанды Баянки, Виктории С. Уильямс, Янива Хиниц, Джорджии Бергамин и Владимира Снеткова по разработке описанных протоколов, а также Генри Рёлю, Кристине Хаммонд, Дэвиду Лангенау и Питеру Карри за совместное использование плазмид или линий рыбок данио. SMH является научным сотрудником Совета по медицинским исследованиям (MRC) с программным грантом G1001029, MR/N021231/1 и MR/W001381/1support. Ma провела mrc doctoral training program PhD Studentship от Королевского колледжа Лондона. Эта работа выиграла от тригонометрического вклада Дэвида М. Робинсона, ученого, наставника и друга.
Materials
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | – | – |
| Aerosol vacuum | – | – | – |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | – |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | – |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | – | – | – |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | – | – |
| Fish medium, Fish water | – | – | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | – | – | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | – |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | – |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | – | – |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | – |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | – |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | – |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | – | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | – |
| Soldering iron | – | – | – |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | – | – |
| Watchmaker forceps, No. 5 | – | – | – |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | – | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | – | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | – | – | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | – | – |
References
- Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
- Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
- Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
- Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
- Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
- Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
- Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
- Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
- Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
- Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish – Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
- Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
- Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
- Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
- Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
- Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
- Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
- Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. 발생학. 424 (2), 162-180 (2017).
- Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
- Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
- Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
- Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
- Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
- Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
- Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. 발생학. 358 (1), 102-112 (2011).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. 발생학. 431 (2), 321-335 (2017).
- Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. 발생학. 423 (1), 24-33 (2017).
- Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
- Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
- Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book – A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
- Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
- Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
- Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
- Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
