realtid og gentagen måling af skeletmuskelvækst hos individuelle levende zebrafisk udsat for ændret elektrisk aktivitet
Summary
Optisk klarhed er en stor fordel for cellebiologisk og fysiologisk arbejde i zebrafisk. Der beskrives robuste metoder til måling af cellevækst hos enkelte dyr, der giver ny indsigt i, hvordan vækst af skeletmuskulatur og nabovæv integreres med hele kroppens vækst.
Abstract
En række metoder kan bruges til at visualisere individuelle celler i hele kroppen af levende embryonale, larve eller unge zebrafisk. Vi viser, at levende fisk med fluorescerende mærkede plasmamembraner kan scannes i et konfokal laserscanningsmikroskop for at bestemme mængden af muskelvæv og antallet af muskelfibre, der er til stede. Effektive metoder til måling af celleantal og -størrelse hos levende dyr over tid beskrives og valideres mod mere vanskelige segmenteringsmetoder. Der beskrives metoder, der tillader kontrol af muskelelektrisk og dermed kontraktil aktivitet. Tab af skeletmuskulatur kontraktil aktivitet reducerede muskelvæksten kraftigt. I larver beskrives en protokol, der tillader genindførelse af mønstret elektrisk fremkaldt kontraktil aktivitet. De beskrevne metoder minimerer effekten af interindividuel variabilitet og vil muliggøre analyse af effekten af elektriske, genetiske, lægemiddel- eller miljømæssige stimuli på en række cellulære og fysiologiske vækstparametre i forbindelse med den levende organisme. Langsigtet opfølgning af de målte virkninger af en defineret tidlig intervention på enkeltpersoner kan efterfølgende udføres.
Introduction
Reguleret vævsvækst, der omfatter stigning i celleantal (hyperplasi) og / eller cellestørrelse (hypertrofi), er en afgørende faktor i udvikling, regenerering og økologisk og evolutionær tilpasning. På trods af enorme fremskridt inden for molekylær genetisk forståelse af både celle- og udviklingsbiologi i de seneste årtier er mekanistisk forståelse af reguleringen af væv og organstørrelse stadig i sin vorden. En af grundene til denne lakune i viden er vanskeligheden ved at kvantificere vævsvækst i levende organismer med den nødvendige rumlige og tidsmæssige nøjagtighed.
Forskellige aspekter af vækst af hele organismer kan måles gentagne gange over tid og afsløre vækstkurver for hver enkelt 1,2,3,4,5. Stadig mere sofistikerede scanningsmetoder, såsom dobbelt røntgenabsorptiometri (DXA), computertomografi (CT) og magnetisk resonansbilleddannelse (MRI), tillader sporing af vækst af hele organer og andre kropsregioner (for eksempel individuelle identificerede skeletmuskler) hos enkeltpersoner, både menneskelige og i modelorganismer 6,7,8,9,10 . Imidlertid har disse metoder endnu ikke opløsningen til at afsløre individuelle celler, og dermed har forbindelserne mellem cellulær adfærd og vævsniveauvækst været svære at skelne. For at skabe sådanne forbindelser har traditionelle undersøgelser ofte været afhængige af kohorter af lignende individuelle dyr, hvoraf nogle få ofres på successive tidspunkter og derefter analyseres i cytologiske detaljer. Sådanne tilgange kræver et gennemsnit af de observerede ændringer på tværs af grupper af (helst ens, men ikke desto mindre variable) individer og lider således af mangel på tidsmæssig og rumlig opløsning, hvilket gør det svært at finde korrelerede begivenheder på celleniveau, der tyder på årsag og virkning.
Undersøgelser af hvirvelløse modelorganismer, oprindeligt i C. elegans og D. melanogaster, har omgået disse problemer ved at udvikle optisk mikroskopi for at opnå cellulær opløsning og nøjagtigt måle vækst over tid hos enkeltpersoner. Sådanne undersøgelser har afsløret påfaldende invariant celleafstamningsadfærd i væksten af disse små modelorganismer 11,12,13,14,15,16,17. Imidlertid har mange dyr, herunder alle hvirveldyr, ubestemte cellelinjer og styrer vævsvækst ved mystiske feedbackprocesser, der tjener til at gøre det genetisk kodede vækstprogram til en funktionel tredimensionel organisme med alle dets bestanddele og organer, der passer til størrelse. For at forstå disse komplekse vækstprocesser er det ønskeligt at afbilde hele væv eller organer over tid hos enkeltpersoner, der kan manipuleres eksperimentelt ved genetiske, farmakologiske eller andre indgreb på et valgtidspunkt, og effekten analyseres efterfølgende.
Hver hvirveldyr skeletmuskel har en defineret størrelse, form og funktion og velkarakteriserede interaktioner med tilstødende væv, såsom knogler, sener og nerver. Nogle muskler er små, ligger lige under huden og er derfor gode kandidater til billeddannelsesundersøgelser i høj opløsning. I lighed med de fleste organer vokser hver muskel gennem embryonalt, postnatalt og ungdomsliv, før de når en stabil voksenstørrelse. Muskler har imidlertid også en unik evne til at ændre størrelse i voksenlivet, afhængig af brug og ernæring18, og denne egenskab har stor indflydelse på organismens fitness, sportslige præstationer og uafhængig levevis. Tab af muskelmasse og funktion i alderdommen, sarkopeni, er et spørgsmål om stigende bekymring for samfund, der står over for en aldrende befolkning 19,20,21.
Vi og andre har fokuseret på væksten af definerede blokke af skeletmuskelvæv i den segmentalt gentagende krop af zebrafisklarver, som et tilsyneladende lukket system indeholdende flere hundrede celler, hvor vævsvækst, vedligeholdelse og reparation kan observeres og manipuleres 22,23,24,25,26. Mens noget kvantitativt arbejde tidligere er blevet rapporteret 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, er der ingen detaljeret og valideret metode til måling af muskelvækst i cellulære detaljer i individuelle hvirveldyrorganismer over tid. Her beskrives en effektiv protokol for, hvordan man udfører sådanne gentagne målinger sammen med validering, og der gives et eksempel på dets anvendelse til at analysere ændringer i både hypertrofisk og hyperplastisk vækst som reaktion på ændret elektrisk aktivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her rapporterer vi en metode til nøjagtig og effektiv estimering af muskelvolumenet hos levende zebrafisklarver i stadier eller i genetiske varianter, hvor pigmentering ikke er en stor hindring for billeddannelse, og når forbigående anæstesi og / eller immobilisering tolereres godt. Mens vi har anvendt laserscanning af konfokal mikroskopi, er de beskrevne tilgange anvendelige til spinding af diskkonfokal eller lysarkmikroskopi og til enhver anden metode, der skaber stakke af billeder på forskellige fokusplaner. En r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne står i dyb gæld til indsatsen fra Hughes-laboratoriemedlemmerne Dr. Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin og Vladimir Snetkov for udvikling af de beskrevne protokoller og til Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau og Peter Currie for at dele plasmider eller zebrafisklinjer. SMH er en medicinsk forskningsråd (MRC) videnskabsmand med programbevilling G1001029, MR / N021231/1 og MR / W001381/1support. MA havde et MRC-ph.d.-uddannelsesprogram ph.d.-studerende fra King’s College London. Dette arbejde nød godt af det trigonometriske input fra David M. Robinson, lærd, mentor og ven.
Materials
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | – | – |
| Aerosol vacuum | – | – | – |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | – |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | – |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | – | – | – |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | – | – |
| Fish medium, Fish water | – | – | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | – | – | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | – |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | – |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | – | – |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | – |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | – |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | – |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | – | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | – |
| Soldering iron | – | – | – |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | – | – |
| Watchmaker forceps, No. 5 | – | – | – |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | – | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | – | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | – | – | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | – | – |
References
- Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
- Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
- Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
- Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
- Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
- Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
- Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
- Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
- Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
- Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish – Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
- Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
- Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
- Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
- Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
- Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
- Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
- Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. 발생학. 424 (2), 162-180 (2017).
- Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
- Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
- Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
- Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
- Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
- Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
- Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. 발생학. 358 (1), 102-112 (2011).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. 발생학. 431 (2), 321-335 (2017).
- Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. 발생학. 423 (1), 24-33 (2017).
- Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
- Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
- Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book – A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
- Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
- Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
- Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
- Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
