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신경과학

생리학적 조건하에서의 알파-시뉴클레인 구조역학 연구를 위한 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법

Published: June 23, 2022
doi:
10.3791/64050
,
1Living Systems Institute, Department of Biosciences,University of Exeter

Summary

단량체 알파 시누클레인의 구조적 앙상블은 생리 기능과 물리 화학적 특성에 영향을 미칩니다. 본 프로토콜은 밀리초 수소/중수소-교환 질량 분광법 및 후속 데이터 분석을 수행하여 생리학적 조건 하에서 본질적으로 무질서한 단백질의 단량체에 대한 형태 정보를 결정하는 방법을 기술한다.

Abstract

알파 시누클레인 (aSyn)은 파킨슨 병의 특징 인 Lewy 몸과 신경 고리에 피브릴라 응집체가 풍부한 본질적으로 무질서한 단백질입니다. 그러나, 그의 생물학적 활성의 대부분은, 그것의 응집뿐만 아니라, 중앙적으로는 단백질의 가용성 단량체 형태를 포함한다. aSyn 생물학 및 병태생리학의 분자 메커니즘에 대한 해명은 구조적으로 고도로 분해된 방법을 필요로 하며 생물학적 조건에 민감하다. 그것의 본래 펼쳐진, 메타 안정한 구조는 단량체 aSyn을 많은 구조 생물학 기술에 다루기 어렵게 만든다. 여기에서는 이러한 접근법 중 하나의 적용이 설명됩니다 : aSyn과 같은 열역학적 안정성이 낮고 보호 인자가 약한 단백질을 연구하기 위해 밀리 초 시간 척도의 수소 / 중수소 교환 질량 분광법 (HDX-MS)이 설명됩니다. 밀리초 시간 척도에서 HDX-MS 데이터에는 aSyn의 용매 접근성 및 수소 결합 구조에 대한 정보가 포함되어 있으며, 이는 더 긴 라벨링 시간에 손실되어 궁극적으로 아미노산 수준까지 구조적 분해능을 산출합니다. 따라서 HDX-MS는 형태 역학 및 열역학, 분자 내 및 분자 간 상호 작용, 돌연변이 또는 환경 조건에 대한 변경의 구조적 영향에 대한 높은 구조적 및 시간적 해상도로 정보를 제공 할 수 있습니다. 광범위하게 적용가능하지만, 단량체 aSyn에서 밀리초 HDX-MS 측정을 획득, 분석 및 해석하는 방법이 입증된다.

Introduction

파킨슨 병 (PD)은 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 신경 퇴행성 질환입니다1. 그것은 뇌의 흑질파 콤팩타 영역에서 Lewy 바디 및 Lewy 뉴라이트로 알려진 세포질 내포물의 형성을 특징으로합니다. 이들 세포질 내포물은 본질적으로 무질서한 단백질 aSyn2의 응집체를 함유하는 것으로 밝혀졌다. PD 및 다른 synucleinopathies에서, aSyn은 가용성 무질서 상태에서 불용성, 고도로 구조화 된 병적 상태로 변형된다. 그것의 본래 형태에서, 단량체성 aSyn은 그것의 N- 및 C-테르미니 사이 장거리 정전기 상호 작용 및 그것의 C-말단 및 비-아밀로이드 베타 성분 (NAC) 영역 3,4,5,6 사이의 소수성 상호작용에 의해 안정화된 광범위한 입체 형태를 채택한다. 돌연변이, 번역 후 변형 및 국소 환경의 변화와 같은 이러한 안정화 상호 작용의 중단은 단량체의 오폴딩으로 이어질 수 있으며, 따라서 응집 과정을 촉발시킬 수 있습니다7.

aSyn 8,9,10,11의 올리고머 및 피브릴라 형태에 대한 방대한 양의 연구가 존재하지만, 단백질의 단량체 형태를 연구하고 어떤 순응자가 기능적인지 (그리고 어떻게) 그리고 어떤 것이 응집되기 쉬운지를 더 잘 이해할 필요가 있습니다8,9,10,11 . 본질적으로 무질서하고, 크기가 14 kDa에 불과하고, 결정화하기 어려우며, aSyn 단량체는 대부분의 구조적 생물학적 기술에 복종할 수 없다. 그러나 단량체 aSyn의 형태 역학을 측정 할 수있는 한 가지 기술은 밀리 초 HDX-MS이며, 이는 최근에12,13,14를 얻는 것이 어렵거나 불가능한 중요한 구조적 관찰을 생성했습니다. 밀리초 HDX-MS는 아미드 수소에서 동위원소 교환을 모니터링하여 단백질 입체 앙상블의 평균을 민감하게 측정하여 밀리초 시간 척도에서 특정 단백질 영역의 용매 접근성 및 수소 결합 네트워크 참여를 나타냅니다. HDX-MS의 밀리 초 측면을 강조 할 필요가 있는데, 이는 기본적으로 펼쳐진 메타 안정 특성으로 인해 aSyn은 기존 HDX-MS 시스템의 하한보다 훨씬 낮은 매우 빠른 수소 교환 동역학을 나타내기 때문입니다. 예를 들어, 대부분의 aSyn 분자는 1 s 미만의 세포 내 조건 하에서 중수소와 완전히 수소를 교환했습니다. 몇몇 실험실은 이제 빠른 혼합 계측기를 구축했습니다. 이 경우 50ms의 데드 타임과 1ms의 시간 분해능으로 HDX-MS를 수행 할 수있는 프로토 타입 고속 혼합 담금질 흐름 기기가15 사용됩니다. 밀리 초 HDX-MS는 최근 aSyn의 연구에서 매우 중요하지만, 본질적으로 무질서한 단백질 / 영역을보다 광범위하게 연구하고 약하게 안정적인 루프 / 영역을 가진 많은 수의 단백질을 연구하는 데 가치가 있습니다. 예를 들어, 펩티드 약물 (예를 들어, 인슐린; GLP-1/글루카곤; tirzepatide) 및 펩티드-융합 단백질 (예를 들어, HIV 억제제 FN3-L35-T1144)은 용액-상 구조 및 안정성 정보가 약물 개발 결정에 중요한 입력이 될 수 있는 주요 약물 포맷이지만, 펩티드 모이어티는 종종 초적 시간 척도16,17,18,19,20에서 HDX-MS에 의해 약하게 안정하고 난치성일 뿐이다. . 초/분 도메인에서 표지를 갖는 창발적 HDX-MS 방법은 DNA G-사분면체에 대한 구조적 정보를 도출하는 것으로 나타났지만, 밀리초 HDX-MS21의 적용에 의해 이를 보다 다양한 올리고뉴클레오티드 구조로 확장할 수 있어야 한다.

HDX-MS 실험은 세 가지 상이한 수준에서 수행될 수 있다: (1) 상향식 (이에 의해 표지된 단백질은 단백질분해적으로 소화됨), (2) 중간-다운 (이에 의해 표지된 단백질은 단백질분해적으로 소화되고, 생성된 펩티드는 연질-단편화 기술에 의해 추가로 단편화됨), 및 (3) 하향식 (이에 의해 소프트-단편화 기술이 표지된 단백질을 직접 단편화함)22 . 따라서, 하위분자 HDX-MS 데이터는 우리가 단백질의 특정 영역에 대한 교환 거동을 국부화할 수 있게 해주므로, 그러한 실험에 대해 적절한 서열 커버리지를 갖는 것이 매우 중요하다. 임의의 HDX-MS 실험의 구조적 분해능은 소화 또는 연질 단편화시 단백질로부터 유래된 단백질 분해 펩티드 또는 단편의 수에 각각 의존한다. 위에서 설명한 세 가지 실험 유형 각각에서, 각 펩티드/단편에서의 아미드 교환의 변화는 단백질의 국부적인 영역의 거동을 나타내기 위해 단백질의 일차 구조에 다시 매핑된다. 가장 높은 구조적 분해능은 소프트 단편화를 통해 달성되지만, 이러한 실험에 대한 설명은 aSyn 단량체 입체 형태의 측정에 초점을 맞춘 현재 연구의 범위를 벗어납니다. 여기에 설명된 일반적으로 적용되는 “상향식” 워크플로를 통해 우수한 결과를 얻을 수 있습니다.

여기서, 절차는 (1) aSyn 샘플 및 HDX-MS 버퍼를 준비하고 처리하는 방법, (2) 상향식 HDX-MS 실험을 위한 펩티드 매핑을 수행하는 방법, (3) 생리학적 조건, 특히 밀리초 시간 영역에서 단량체성 aSyn에 대한 HDX-MS 데이터를 획득하는 방법(맞춤형 장비 사용; 밀리초 라벨링을 위한 대체 기기도 설명됨)에 대해 제공된다. (4) HDX-MS 데이터를 처리하고 분석하는 방법. 두 용액 조건에서 생리학적 pH (7.40)에서 단량체성 aSyn을 사용하는 방법이 여기에 예시된다. aSyn의 연구에 매우 유용하지만, 이러한 절차는 모든 단백질에 적용될 수 있으며 본질적으로 무질서한 단백질에만 국한되지 않습니다.

Protocol

1. aSyn의 단백질 발현 및 정제 이전에 게시된 보고서 다음에 aSyn을 준비합니다 9. 안전한 저장 완충액(예를 들어, 트리스, pH 7.2)으로 투석한다. 필요한 경우, 샘플을 농축한다 (예를 들어, 약 10-30분 동안 3 kDa MWCO, 14,000 x g 를 사용하는 스핀 필터 마이크로원심분리 튜브, 재료 표 참조).참고 : 지나치게 집중하지 않는 것이 좋습…

Representative Results

본질적으로 무질서한 특성으로 인해 생리적 pH에서 aSyn의 복잡한 구조적 변화를 포착하는 것은 어렵습니다. HDX-MS는 백본 아미드 수소에서 동위원소 교환을 모니터링하여 단백질 형태 역학 및 상호 작용을 조사합니다. 높은 구조적 및 시간적 해상도에서이 정보를 얻는 몇 안되는 기술 중 하나입니다. 이 프로토콜은 광범위한 단백질 및 완충액 조건에 광범위하게 적용가능하며, 이는 단계 2.1.-2.2에 ?…

Discussion

본 기사에서, 다음의 절차가 기술된다: (1) 가장 높은 서열 커버리지를 얻기 위해 단량체성 aSyn에 대한 펩티드 매핑 실험을 수행하고, (2) 생리학적 조건 하에서 단량체성 aSyn에 대한 밀리초 HDX-MS 데이터를 획득하고, (3) 생성된 HDX-MS 데이터의 데이터 분석 및 해석을 수행한다. 제공된 절차는 일반적으로 실행이 간단하며, 각 라벨링 실험은 일반적으로 세 번의 반복실험과 8개의 시간 지점에 대해 약 8?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NS는 University Council Diamond Jubilee Scholarship의 지원을 받습니다. JJP는 UKRI Future Leaders Fellowship [Grant number : MR / T02223X / 1]의 지원을 받습니다.

Materials

1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column  Waters Corporation 186002346 Analytical column
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv VWR 20060.420 For LC mobile phases
CaCl2 Sigma Aldrich C5670 Salt for HDX buffers
Chronos Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) 667006090 Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell
Deuterium chloride Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-2-50 For HDX labelling buffers
Deuterium oxide (99.9% D2O) Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-4 Deuterated water
DynamX 3.0 Waters Corporation 176016027 Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation
Enzymate BEH Pepsin Column Waters Corporation 186007233 Pepsin digestion column
Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade Fisher Scientific 10596814 For LC mobile phases
Guanidinium hydrochloride Sigma Aldrich RDD001-500G Chaotrope/Denaturant
HDfleX University of Exeter N/A https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KCl Sigma Aldrich P3911 Salt for HDX buffers
LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot Waters Corporation 725000637 Autosampler robot
Leucine enkephalin Waters Corporation 186006013 For mass spectrometry lockspray calibration.
MassLynx Waters Corporation 667004007 Software controlling inlet methods and mass spectrometer
Maximum recovery vials Waters Corporation 600000670CV 100 pack including caps – used for quench tray in LEAP HDX-2
MgCl2 Sigma Aldrich M8266 Salt for HDX buffers
Millipore 0.22 µm syringe filters Millipore N9CA7069B Syringe filters
ms2min Applied Photophysics Ltd N/A fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument
NaCl Sigma Aldrich S9888 Salt for HDX buffers
Peltier temperature controller LEAP Technologies Inc. HP115-COOL/D Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.
ProteinLynx Global Server 3.0 Waters Corporation 715001030 Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.
Reagent pot caps Waters Corporation 186004632 100 pack
Reagent pots for LEAP HDX-2 Waters Corporation 186001420 100 pack excluding caps – used for buffers in LEAP HDX-2
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-57 For HDX labelling buffers
Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) Amicon (Merck Sigma Aldrich) UFC5003 Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.
Synapt G2-Si mass spectrometer Waters Corporation 176850035 Mass spectrometer
Total recovery vials Waters Corporation 600000671CV 100 pack including caps – used for labelling tray in LEAP HDX-2
Tris-HCl Sigma Aldrich T3253-250G Buffer
Trizma base Sigma Aldrich T60040-B2005 Buffer
Urea Sigma Aldrich U5378-1KG Chaotrope/Denaturant
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column  Waters Corporation 186004623 Trap desalting column
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References

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Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions. J. Vis. Exp. (184), e64050, doi:10.3791/64050 (2022).
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