嫌気性増殖細菌によるマウス膣コロニー形成モデル

すべての動物実験は、カリフォルニア大学サンディエゴ校の機関ガイドラインおよび実験動物の世話と使用のためのガイド(UCSD、プロトコル番号:S20057、2020年以降)に従って承認および実施され、それ以前はセントルイスのワシントン大学(プロトコル20110149、2020年まで)。 注:以下のプロトコルは、接種時に6〜11週齢の従来の雌C57Bl /マウスを利用しています。関連する引用された作品で以前に使用されたベンダー情報と特定の年齢範囲に注意してください。 1.β-エストラジオール17-吉草酸の調製と投与 注:β-エストラジオール17-吉草酸は発がん性物質であり、皮膚から吸収される生殖毒素です27,28。粉末および液体溶液の取り扱い中は、適切なPPEを着用してください。また、水生毒素29でもあります。適切に密封され、ラベル付けされた容器に適切に廃棄してください。 フィルター 50mLのコニカルチューブ真空フィルターシステムを使用して、0.22μmのフィルターを通して最大50mLのゴマ油を滅菌します。無菌性を維持するために、バイオセーフティキャビネット内でのみ開いてください。 実験に必要なβ-エストラジオール吉草酸溶液の量を計算します:マウスあたり200 μLに加えて、シリンジ充填中のサンプル損失を考慮して2〜3 mL余分に(たとえば、10マウスの実験には合計4 mLが必要です)。5 mg/mL溶液を作るのに必要な吉草酸β-エストラジオールの量を計算し、14 mLの丸底チューブで直接計量します。 14 mLチューブをしっかりと蓋し、ボルテックスして粉末の塊を破壊します(これにより、吉草酸β-エストラジオールがより迅速に溶解できるようになります)。滅菌ろ過したゴマ油を14 mLチューブに加えて、吉草酸β-エストラジオールの最終濃度が5 mg / mLになるようにします。 しっかりと蓋をした14 mLチューブをローテーターに37°Cで30〜40分間置き、固体粉末が完全に溶解するまで待ちます。マウスに注射する前に溶液の均一性を視覚的に確認します。37°Cでインキュベートすると、ごま油の粘度が低下し、注入が容易になります。 吉草酸β-エストラジオール溶液を1 mLシリンジ(針なし)に引き出します。泡を導入せずにこれを行うには、まず少量の溶液を引き出してから、シリンジの先端をゴマ油に入れたまま静かに排出します。100 μLマークをわずかに超えて、ゆっくりと溶液を再び引き上げます。 25 G x 5/8インチの針をシリンジに置きます。次に、ゴマ油溶液が針先から出始めるまでゆっくりと排出して、針をプライミングします。シリンジが100μLマークになるまで溶液を排出します。マウスごとに1つのシリンジを準備します。 接種の48時間または72時間前に腹腔内注射によりβ-エストラジオール17-吉草酸塩を投与します。.前述のように、各マウスに100 μLの5 mg / mL β-エストラジオールバレレート溶液(0.5 mg β-エストラジオールバレレート/マウス)を注射します22,30。残りの溶液を次の注入まで4°Cで72時間保存します。 β-エストラジオール吉草酸塩溶液を接種当日、マウスの膣接種の直前に再度投与する。溶液を4°Cから取り出し、37°Cのローテーターに30分間置いてから注入し、ゴマ油を温めて粘性を弱めます。ステップ1.7の説明に従って注射を続行します。 2.接種材料の調製 注:このセクションには、嫌気的に成長したストレプトマイシン耐性ガードネレラ膣JCP8151B-SmR24,25,31,32から接種菌を調製するための一般的な手順が含まれています。このセクションのすべてのステップは、嫌気性チャンバーで行う必要があります。 調製したNYC IIIブロス、寒天、PBSなどの試薬を嫌気性チャンバーに入れて、使用前に少なくとも24時間平衡化します。注:ここでは、5%水素ガス混合物で平衡化されたビニール嫌気性チャンバーを使用しました。内部酸素濃度は通常0ppmですが、材料をチャンバーに循環させると、低レベルの過渡的な増加(10〜25 ppm)が発生する可能性があります。 膣接種の2日前に、凍結グリセロールストックから嫌気室のNYC III寒天プレートに ガードネレラ をストリークアウトします。ドライアイスで満たされた小さな容器(空のピペットチップボックスなど)を使用して、チャンバーへの輸送中およびチャンバーからの輸送中にグリセロールストックを凍結状態に保ちます。 膣接種の1日前に、プレートから5〜10個の ガードネレラ コロニーを使用して、10mLのNYC IIIブロスを接種します。液体培養液を37°Cで16時間一晩増殖させます。 接種せずに放置した培養培地の2番目の1 mLアリコートを含め、接種した培養液と一緒にインキュベートして、培地が汚染されていないことを確認します。 下記のように液体培養から接種材料を調製する。できるだけ嫌気室で接種剤の準備を行います。1.5 mL キュベット(1:5 希釈)中の800 μLのフレッシュ培地に200 μLの培養液を加えて、培養光学密度(OD)を測定します。分光光度計を使用して、波長600 nmで希釈した培養物の密度(OD)を測定します(ブランクとして新鮮な培地のみを使用した別のキュベットを使用します)。ODの読み取り値に5を掛けて、16時間の培養の実際のOD600 を取得します。 実験に必要な接種材料の量を計算します。例えば、15匹のマウスに1匹あたり20 μLの接種材料を感染させるには、15 x 20 μL = 300 μLの接種材料が必要です。必要以上に約25%多くの接種材料を準備するため、15匹のマウスに対して、300 μL+(0.25 x 300 μL)= 375 μLの接種材料を準備します。 ステップ2.4.1で決定したOD 600を使用して、ステップ2.4.2で計算された容量でOD600 = 5.0接種材料を得るためにスピンダウンして再懸濁する必要がある16時間の培養液の体積を計算します。例えば、培養液のOD600が1.5で、必要な接種量が375 μLの場合、スピンダウンする培養液量は(375 μL x 5)/1.5 = 1250 μLです。 ステップ2.4.3で計算した培養量をピペットで入れます。滅菌マイクロ遠心チューブに入れます。16,000 x g で1〜3分間遠心分離して細菌をペレット化します。 上清を除去し、ステップ2.4.2で計算された容量で嫌気性PBSにペレットを再懸濁します。接種材料は、5.0の計算されたOD600 になります。該当する場合は、非感染対照群におけるマウスのビヒクル対照として機能するPBSのチューブも調製する。 嫌気性チャンバーから接種チューブを取り外す前に、PBSで1:10から1:10 x 106までの連続希釈シリーズを準備します。スポットプレート5は、マルチチャンネルピペットを用いて寒天プレート上に各希釈液を複製し、接種材料のCFUを測定した。これが接種前のCFUです。 3.膣の事前洗浄とガードネレラの接種 嫌気性チャンバーで膣洗浄/洗浄チューブを準備します(これは、ステップ2.4の接種材料の準備と同時に行うことができます)。70 μLの滅菌嫌気性PBSを、マウス番号でラベル付けされた1.5 mLマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。マウス1匹につき1本の洗浄チューブを用意します。チューブをしっかりと閉じて、嫌気室から取り出します。 ステップ3.1で調製した個々のチューブから50 μLの嫌気性PBSを使用して、各マウスに膣洗浄を行います。これらの膣洗浄剤は接種前の洗浄液であり、下流の測定やアッセイに使用できます。2回目の吉草酸β-エストラジオール注射(ステップ1.8)の投与後、各マウスをケージまたは前足でつかむことができる清潔で硬い表面の上に置きます。尾の中央部分をそっとつかみ、後部がわずかに高くなり、膣口が露出するように持ち上げます。 ピペットとp-200フィルターチップを使用して、適切なマウスに対応する洗浄チューブから50 μLのPBSを吸引します。ピペットチップを膣内腔~2-3 mmにそっと挿入し、50 μLの容量を3x-4xで穏やかにピペットで出し入れします。 回収した洗浄材(~50 μL)を元の洗浄チューブに戻し、残りの20 μLのPBSが残っている洗浄チューブ内で上下にピペッティングします。粘液が過剰でチップが詰まった場合は、きれいなp-200チップを使用して残りの材料を収集し、同じ洗浄チューブに入れます。 20 μLの濃縮細菌懸濁液またはビヒクルコントロールを各マウスの膣に経膣投与します。.そのマウスの膣洗浄の直後に各マウスに接種します(すなわち、次のマウスに移る前に、各マウスに対して洗浄と接種を順番に実行します)。このプロセスを簡素化するために、2台のp200ピペット(1台は洗浄用に50 μL、もう1本は接種用に20 μL)を使用します。手順 3.2.1 の説明に従ってマウスを拘束します。p-200チップを使用して、20μLの細菌懸濁液を膣内にピペットで入れます。2つの異なる菌種/菌株を用いた同時接種実験では、各菌液10μLを使用し、接種前に2つの菌株を混合しないでください。注:膣からのこぼれを避けるために、総接種量は20μLを超えてはなりません。. 各マウスの後端を10〜20秒間保持して、投与された量が膣内口にすぐに溜まらないようにします。.次に、マウスを新しいケージ/レセプタクルに入れるか、すでに接種済みのケージメイトと一緒に置きます。 手順 3.2 を繰り返します。およびステップ3.3。マウスごとに。まだ接種されていない動物と一緒にケージにマウスを戻さないでください。これにより、接種前にマウスがストレプトマイシン耐性菌に不注意にさらされることを防ぎます。 すべてのマウスに接種した後、接種チューブを嫌気性チャンバーに戻します。ステップ2.5で説明されているように、別の段階希釈液を調製してプレートします。これは接種後のCFUです。接種後プレートと接種前プレートのCFUを比較して、動物の接種中に嫌気室の外にいる間に接種材料の生存率が低下したかどうかを判断します。 ステップ3.2で収集した膣洗浄液をプレートします。選択的寒天(この場合、1 mg / mLストレプトマイシン)で。プレートを37°Cの嫌気性チャンバーで1〜2日間インキュベートし、成長を調べます。注:成長は、マイクロバイオームの内因性メンバーが選択マーカーに耐性があり、したがって、標的生物のCFU列挙を不明瞭にする可能性があることを示しています。 4.実行可能な ガードネレラ コロニー形成を決定するための膣洗浄の収集 選択した時点で膣洗浄を収集して、膣のコロニー形成を分析します。手順 3.2 の説明に従って収集します。 採取直後に、膣洗浄液を嫌気性チャンバーに入れます。各洗浄液10 μLを使用して、ステップ2.5の説明に従って、選択的寒天への段階希釈とプレーティングを行います。 ガードネレラ (または関心のある別の嫌気性菌)による膣コロニー形成の尺度としてCFUカウントを使用します。 5.犠牲、解剖、および組織の均質化 各マウスから採取する臓器ごとに5 mLのチューブを準備します(たとえば、膣、子宮頸部、子宮がすべて採取されている場合は、マウスごとに3本のチューブを準備します)。嫌気性チャンバー内で各チューブに滅菌嫌気性1x PBS(または他のホモジナイズ媒体)を充填します。膣と子宮頸部を採取するチューブには1 mLのPBSを使用し、子宮角の採取に使用するチューブには750 μLを使用します。 PBSを追加したら、個々のチューブの重量を測定します(これは収集前の重量であり、採取された各組織の総重量を決定するために使用されます)。嫌気性チャンバーでスケールが利用できない場合は、チューブにしっかりと蓋をしてチャンバーから取り出して計量し、サイクルインに戻します。注:チューブの準備と体重の収集は、犠牲の1日前に行うことができますが、チューブは、蒸発を防ぐためにキャップをしっかりと密閉した状態で嫌気性チャンバーに保管する必要があります。 手順3.1の説明に従って、膣洗浄チューブのセットを準備します。犠牲で最後の洗浄を集めるために。また、脱イオン(DI)水の50 mLビーカーと、犠牲中に標準的な鋼製解剖器具をすすぎおよび滅菌するために使用する70%〜90%エタノールの2番目の50 mLビーカーを準備します。 嫌気室からPBSで満たされた臓器収集チューブを循環させます。組織を追加する準備ができるまで、チューブをしっかりと閉じたままにします。 IACUCが承認した方法を使用して各マウスを犠牲にします。手順3.2.2の説明に従って、最後の洗浄を実行します。および3.2.3。犠牲の直前または直後のいずれか。 解剖と組織採取を開始します。各マウスの腹部と背中に70%エタノールをスプレーします。エタノールのビーカーでハサミを滅菌し、乾燥させてから、マウスの腹部骨盤腔を垂直に1回切ります。 滅菌鉗子を使用して皮膚を引き戻し、腸を体腔から開放視野の側面にそっと押し出し、生殖管を露出させます。注意: 実験結果を混乱させる可能性のあるストレプトマイシン耐性菌が宿っている可能性があるため、腸に穴を開けたり穴を開けたりしないように注意してください。 最大の膣組織を集めるには、剖検中に恥骨を壊します。滅菌ハサミを使用して、膣に食い込まないように注意しながら恥骨の中心(恥骨結合)を切り取ります。2組の滅菌鉗子を使用して、骨盤の両側をつかみ、骨盤を横方向に引き開き、下の膣の下部を露出させます。 鉗子を使用して子宮頸部(周囲の組織に比べて硬い構造)をそっとつかみます。子宮頸部をそっと引き上げて、後ろに隠れて膣に密接に接続されている結腸を露出させます。 小さなはさみを使用して、外部結合組織から膣を解放します。膣を結腸から慎重に分離し、腸管に穴を開けないようにしてください。完全に解放されたら、ハサミでイントロイトの膣を脇に置き、マウスの体から解放するために切り取ります。 子宮角をより目立たせるためにわずかに引き上げながら、子宮頸部を優しく握り続けます。一方、左右の卵巣の真下を切り、子宮角を解放します。切断された生殖管を体腔から取り外し、滅菌ペトリプレートに入れます。 かみそりを使用して、子宮角、子宮頸部、および膣を分離します。各組織をそれぞれのラベル付き収集チューブに入れます。サイトカインを収集する場合は、組織を追加した後にチューブを氷の上に置きます。 ティッシュを追加した後、各チューブの重量を再度測定します。これは収集後の重量です。収集後の重量から収集前の重量を差し引いて、組織の総重量を取得します。 ハンドヘルドホモジナイザーを使用して、収集チューブ内の臓器を均質化します。 ガードネレラ JCP8151Bの場合、バイオセーフティキャビネット(好気性)または嫌気性チャンバーでこのステップを実行します。サンプル間のハンドヘルドホモジナイザーの洗浄と無菌処理のために、数セットのチューブを準備します。各セットに3つの50 mLコニカルチューブがあることを確認します:1つはDI水で満たされ、1つは70%エタノールで満たされ、3つ目は1x PBSで満たされます。マウス治療グループごとに個別の洗浄チューブセットを準備します。 ホモジナイザーを洗浄するには、ブレードを各洗浄チューブ内の液体に下げ、機器を最高速度に回します。ホモジナイザーを3つのチューブのそれぞれに約3秒間保持します。洗浄の順序は、DI水(物理的な破片を除去するため)、次にエタノール(消毒するため)、そして最後に1x PBS(中和するため)です。プローブをペーパータオルまたは使い捨てベンチパッドに振って、各すすぎの間に余分な液体を取り除きます。 最初のすすぎに続いて、ホモジナイザープローブを収集チューブの底まで下げ、下の組織をトラップして組織を均質化します。ホモジナイザーをオンにして組織を粉砕し、水没したままプローブを約5倍にゆっくりと上下に動かします。各臓器を約15〜30秒間均質化します。 ホモジナイザーの電源を切り、チューブから取り外した後、内容物を目視検査して、組織が完全に破壊されていることを確認します。これは、プローブに捕まらないことがある子宮頸部と膣にとって特に重要です。注:子宮角の余分な脂肪が完全に均質化していなくても大丈夫です。 手順5.14.1.-5.14.4を繰り返し、各サンプル間でプローブを洗浄および滅菌します。実験グループごとに新しい洗浄チューブのセットに切り替えます。 均質化されたサンプルを含むチューブを嫌気性チャンバーに移動します。各組織の細菌負荷を決定するには、混合するサンプルを短時間穏やかにボルテックスしてから、段階希釈のために100 μLの組織ホモジネートを除去し、CFU測定のために選択寒天にプレーティングします(最初の希釈は1 x 100です)。下限の検出が必要な場合は、200〜250μLの未希釈ホモジネートのスプレッドプレーティングを実行します。