Utilisation de pincettes optiques doubles et de microfluidique pour les études sur une seule molécule

La capacité de visualiser les interactions protéine-ADN au niveau d’une seule molécule et en temps réel a fourni des informations significatives sur la stabilité du génome ^1,2. En plus de travailler avec des molécules d’ADN uniques une à la fois, la possibilité de visualiser les transactions entre molécules individuelles à proximité fournit des informations supplémentaires ^3,4,5. La manipulation de molécules d’ADN supplémentaires nécessite à la fois des pièges optiques supplémentaires ainsi que des cellules à flux microfluidique multicanaux de haute qualité⁶.

Il existe plusieurs méthodes disponibles pour générer plus d’un piège optique. Il s’agit notamment des miroirs à balayage galvanométrique, des modulateurs optiques acoustiques et de l’optique diffractive, qui génèrent des pincettes optiques holographiques 4,7,8,9. Souvent, les miroirs de balayage et les modulateurs optiques acoustiques produisent des pièges à temps partagé. Dans la configuration décrite ici, le faisceau d’un seul laser Nd:YAG est divisé en polarisation, puis les miroirs à balayage laser galvanomètre contrôlent la position de ce que l’on appelle le piège mobile (Figure 1)⁴. Pour faciliter le positionnement des miroirs et des filtres pour diriger le faisceau de piégeage vers l’ouverture arrière de l’objectif du microscope, un laser HeNe est utilisé. Cela facilite l’alignement global car le faisceau HeNe est visible à l’œil nu, alors que les faisceaux infrarouges ne le sont pas. Le faisceau HeNe est également plus sûr à travailler, ce qui rend le positionnement des miroirs et d’autres composants moins stressant. Initialement, le trajet du faisceau de ce laser est séparé du faisceau de 1064 nm, mais est introduit dans le même trajet du faisceau, puis dans l’objectif du microscope. Une fois l’alignement physique atteint, le positionnement du faisceau de 1064 nm au-dessus du faisceau HeNe est effectué, ce qui est facilité par l’utilisation d’une visionneuse infrarouge et de divers outils d’imagerie du faisceau pour visualiser la position et la qualité du faisceau. Ensuite, l’expanseur de faisceau est introduit et le faisceau infrarouge expansé résultant est aligné sur l’ouverture arrière de l’objectif. Enfin, l’objectif est retiré et la puissance de chaque faisceau polarisé est mesurée et ajustée à l’aide de plaques d’onde λ/2 pour être égale (Figure 1C). Les mesures de puissance sont également effectuées une fois que l’objectif est retourné et il y a généralement une perte de puissance de 53%. Il y a cependant une puissance suffisante pour former des pièges optiques fixes et mobiles stables dans le plan focal (Figure 1D).

Pour imager les transactions d’ADN, les cellules à flux microfluidique jouent un rôle clé car elles permettent des mesures contrôlées au niveau de la molécule unique avec une résolution spatiale et temporelle élevée (Figure 2). Le terme microfluidique désigne la capacité de manipuler des fluides dans un ou plusieurs canaux de dimensions allant de 5 à 500 μm^10,11. Le terme flux fait référence au fluide réel dans un canal et le canal fait référence au canal physique dans lequel un flux de fluide ou des flux se déplacent. La conception de cellules d’écoulement à canal unique a un canal physique commun où les réactions sont observées et il n’y a généralement qu’un seul flux de fluide présent. Ainsi, ces conceptions sont connues sous le nom de cellules d’écoulement à flux unique. En revanche, les cellules d’écoulement multiflux sont définies comme un dispositif microfluidique dans lequel deux canaux d’entrée ou plus convergent en un seul canal physique commun (figure 2A). À l’intérieur du canal commun, les flux de fluide qui proviennent des canaux individuels s’écoulent parallèlement les uns aux autres et restent séparés avec seulement un mélange minimal entre eux en raison de la diffusion (Figure 2B). Dans la majorité des configurations expérimentales, une seule pompe pousse les fluides dans chaque canal à la même vitesse. En revanche, lorsque la direction limite est utilisée, trois pompes ou plus, contrôlées indépendamment, poussent les fluides à travers les canaux. Cependant, chaque pompe fonctionne à une vitesse différente, mais le débit net dans le canal commun est constant¹². Cela permet l’échange rapide des composants du canal principal simplement en modifiant la vitesse de la pompe.

En plus de l’écoulement laminaire, un autre facteur critique est le profil de vitesse parabolique dans le flux de fluide laminaire. La vitesse d’écoulement la plus élevée se produit au milieu du cours d’eau et la plus lente se produit près des surfaces (figure 2C)¹³. Ce profil doit être pris en compte pour étirer complètement une molécule d’ADN qui est attachée à une bille maintenue dans le flux pour une visualisation précise de l’ADN fluorescent et des analyses précises d’une seule molécule. Ici, l’ADN est étiré à la forme B et est maintenu en place sous 0 pN de force. Pour ce faire, la position du piège optique doit être focalisée à une position de 10 à 20 μm de la surface inférieure du couvercle (Figure 2D). Des précautions doivent être prises pour que la molécule d’ADN ne soit pas étirée au-delà de la forme B, car cela peut inhiber les réactions enzymatiques. Dans des conditions tampons typiques, 1 μm = 3 000 pb d’ADN¹⁴. De plus, en piégeant 10 à 20 μm de la lamelle de couverture, le complexe d’ADN est positionné loin de la surface, minimisant ainsi les interactions de surface.

De nombreuses méthodes ont été utilisées pour créer des canaux de dispositifs microfluidiques et celles-ci peuvent être effectuées en laboratoire ou des cellules d’écoulement peuvent être achetées auprès de sources commerciales 6,15,16,17. Les matériaux optimaux utilisés pour construire les cellules d’écoulement doivent être mécaniquement rigides, optiquement transparents avec une faible fluorescence et imperméables aux solvants organiques⁶. Fréquemment, le verre flotté borosilicaté ou la silice fondue sont utilisés pour fournir un environnement d’écoulement stable pendant une période prolongée qui convient au piégeage optique, à la visualisation et à la détection de force. Ces matériaux permettent également l’utilisation de solvants non aqueux (p. ex. méthanol de qualité spectrophotométrique) pour simplifier le mouillage de surface et l’élimination des bulles d’air, et de dénaturants (p. ex. chlorhydrate de guanidinium 6M) ou de détergents pour nettoyer la cellule d’écoulement. Enfin, les méthodes utilisées pour introduire des fluides dans les cellules d’écoulement varient des systèmes complexes de pompes à vide aux pompes à seringue unique 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Dans l’approche décrite ici, on utilise une pompe à seringue pouvant accueillir jusqu’à 10 seringues (figure 3A). Cela offre la flexibilité d’utiliser des cellules d’écoulement à canal unique ou des cellules d’écoulement avec plusieurs canaux d’entrée. Ici, une cellule d’écoulement à trois canaux est utilisée et est accouplée à des seringues maintenues en place sur la pompe à seringue à l’aide d’un tube en polyéther-éther-cétone (PEEK) (figure 3A-C). Le débit des fluides est contrôlé par des vannes de commutation à quatre voies et sert ainsi à minimiser l’introduction de bulles dans la cellule d’écoulement (Figure 3A,D). De plus, les seringues étanches aux gaz Hamilton qui ont des parois de verre rigides et des pistons revêtus de polytétrafluoroéthylène (PTFE) sont recommandées car elles fournissent un mouvement de piston exceptionnellement doux qui est essentiel pour obtenir un écoulement régulier^14,27.

Dans le système expérimental décrit, des cellules d’écoulement avec deux à cinq canaux d’entrée ont été utilisées. Le nombre de canaux d’entrée est dicté par l’expérience en cours. Pour l’étude de RecBCD et Hop2-Mnd1, deux canaux de flux étaient suffisants ^14,28. Pour l’hélicase, l’enzyme a été liée à l’extrémité libre de l’ADN et traduite en un flux contenant du magnésium et de l’ATP pour initier la translocation et le déroulement. Pour Hop2-Mnd1, l’ADN piégé optiquement a été traduit dans le flux de fluide adjacent contenant des protéines et un tampon ± ions métalliques divalents. L’utilisation de cellules d’écoulement à trois canaux permet de piéger l’ADN dans le flux 1, de traduire l’ADN dans le flux 2 pour permettre la liaison aux protéines, puis de lancer le flux 3 où l’ATP est présent, par exemple, pour déclencher des réactions. Une variante de ce qui précède consiste à utiliser une protéine marquée par fluorescence dans le canal 2, ce qui rend le flux de fluide complètement blanc et empêche la visualisation de l’ADN. Lorsque cette molécule est traduite dans le flux 3, les protéines et l’ADN sont maintenant visibles lorsque les réactions sont initiées.

L’utilisation de vannes de commutation à quatre voies pour contrôler le débit de fluide est un élément essentiel du système pour éliminer les bulles dans les cellules d’écoulement. Les bulles nuisent à la stabilité de l’écoulement des fluides car elles se contractent et se dilatent de manière imprévisible, ce qui entraîne des changements rapides de la vitesse d’écoulement et l’introduction de turbulences. Lorsque les vannes sont positionnées entre les seringues et le tube d’admission, le chemin d’écoulement est déconnecté en changeant la position de la vanne lorsque les seringues sont remplacées. Lorsque la nouvelle seringue est mise en place, le piston peut être enfoncé manuellement de sorte que >6 μL est éjecté (le volume mort de la valve) et cela élimine presque entièrement les bulles.

La fixation des connecteurs aux cellules d’écoulement est souvent l’étape limitant la vitesse dans l’utilisation des cellules d’écoulement. Nous décrivons l’utilisation de deux types de connecteurs : amovibles dits press-fit et permanents (assemblages nanoports). Les connecteurs amovibles sont simples à adhérer à une cellule d’écoulement et différents types de tubes flexibles en plus du PTFE recommandé peuvent être testés avec ces connecteurs. Il s’agit d’un moyen rapide et rentable de tester les tubes et les connecteurs sans sacrifier les cellules d’écoulement en verre plus coûteuses. En revanche, les assemblages nanoports sont fixés en permanence, résistent à des pressions allant jusqu’à 1 000 psi et, entre nos mains, leur utilisation est limitée aux tubes en PEEK de différents diamètres. Ce n’est pas un inconvénient car les tubes en PEEK sont utilisés de préférence. Une seule cellule d’écoulement en verre avec des assemblages permanents fixés peut être réutilisée pendant plus de 1 an avec une utilisation prudente.