Summary

트리파노소마 크루지 감염 세포, 휴면 무산소 및 손상되지 않은 정화 장기의 T 세포의 정량적 3D 이미징

Published: June 23, 2022
doi:

Summary

본 프로토콜은 손상되지 않은 깨끗한 장기 및 조직에서 증식 및 휴면 중인 트리파노소마 크루지 기생충 및 T 세포를 시각화하고 정확하게 정량화하기 위한 광시트 형광 현미경 및 자동화된 소프트웨어 지원 방법을 설명합니다. 이러한 기술은 치료 결과를 평가하고 기생충-숙주 상호 작용에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

Abstract

샤 가스 병은 주로 라틴 아메리카에서 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 무시 된 병리학입니다. 샤가스병 치료제인 트리파노소마 크루지 (T. cruzi)는 인간을 포함한 여러 포유류 종을 감염시켜 심장 및 소화기 병리를 유발하는 다양한 생물학을 가진 절대 세포 내 기생충입니다. 샤가스병의 복잡한 생물학을 이해하고 치료 요법의 결과를 정확하게 평가하기 위해서는 T. cruzi in vivo 감염의 신뢰할 수 있는 검출이 오랫동안 요구되어 왔습니다. 현재 프로토콜은 3D 재구성 및 제거 된 장기에서 T. cruzi 감염 세포의 자동 정량화를위한 통합 파이프 라인을 보여줍니다. 라이트 시트 형광 현미경을 사용하면 전체 장기 또는 조직에서 활발하게 증식하고 휴면 상태인 T. cruzi 기생충과 면역 이펙터 세포를 정확하게 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 또한 항체 및 핵 염색으로 제거 된 장기의 균일 한 표지를 얻기위한 CUBIC-HistoVision 파이프 라인이 성공적으로 채택되었습니다. 3D 면역염색과 결합된 조직 투명화는 약물 치료 프로토콜을 종합적으로 평가하고 T. cruzi 감염 조직의 세포 조직에 대한 이해를 향상시키는 편견 없는 접근 방식을 제공하며 샤가스병의 항-T. 크루즈 면역 반응, 조직 손상 및 복구와 관련된 발견을 발전시킬 것으로 기대됩니다.

Introduction

원생동물 기생충 T. cruzi에 의해 발생하는 샤가스병은 세계에서 가장 방치된 열대성 질병 중 하나이며 연간 약 13,000명이 사망합니다. 감염은 종종 부정맥, 심부전 및 갑작스런 사망을 포함하여 환자의 30 %에서 심장 병리를 일으키는 급성에서 만성 단계로 진행됩니다 1,2. 급성기 동안 기생충에 대해 유도 된 강력한 숙주 면역 반응에도 불구하고, 적은 수의 기생충이 심장 및 골격근과 같은 조직에서 숙주의 평생 동안 만성적으로 지속됩니다. 적응 면역 반응의 지연된 발병 및 비 복제 형태의 기생충의 존재를 포함한 몇 가지 요인은 면역계 3,4,5,6에 의한 완전한 제거를 피하기 위해 T. cruzi의 능력에 기여할 수 있습니다. 또한, 복제되지 않는 휴면 형태의 기생충은 트리파노시드 약물에 대한 낮은 감수성을 나타내며 많은 경우 7,8에서 관찰되는 치료 실패의 원인이 될 수 있습니다.

새로운 이미징 기술의 개발은 감염된 조직에서 기생충의 공간적 분포와 통제에 관여하는 면역 세포와의 관계에 대한 통찰력을 얻을 수있는 기회를 제공합니다. 이러한 특성은 면역 체계에 의한 기생충 제어 과정을 더 잘 이해하고 만성 조직에 존재하는 희귀 휴면 기생충을 추적하는 데 중요합니다.

라이트 시트 형광 현미경(LSFM)은 얇은 절편 없이 큰 조직 또는 장기의 3D 이미징을 위한 가장 포괄적이고 편견 없는 방법 중 하나입니다. 라이트 시트 현미경은 얇은 빛의 시트를 사용하여 초점면의 형광단만 여기시키고, 샘플의 광퇴색 및 광독성을 줄이며, 초고속 카메라를 사용하여 수천 개의 조직층의 이미지를 기록합니다. 조직에서 레이저 광의 적절한 침투에 필요한 높은 수준의 조직 투명성은 조직 지질 화 및 탈색 후 굴절률 (RI)을 균질화하여 얻어지며, 이는 빛의 산란을 줄이고 고품질 이미지를 렌더링합니다 9,10,11.

조직 투명화 접근법은 전체 마우스12,13,14, 오가노이드15,16,17, 리포터 형광 마커를 발현하는 기관 18,19,20,21,22,23, 및 최근에는 제한된 수의 인간 조직(24)의 이미징을 위해 개발되었습니다. . 조직 청소를 위한 현재의 방법은 세 가지 제품군으로 분류됩니다: (1) DISCO 프로토콜25,26과 같은 유기 용매 기반 방법, (2) CLARITY 27과 같은 하이드로겔 기반 방법 및 CUBIC (투명하고 방해받지 않는 뇌/신체 이미징 칵테일 및 전산 분석)18,19,28,29와 같은 수성 방법 . CUBIC 프로토콜은 장기 모양과 조직 무결성을 유지하여 내인성으로 발현된 리포터 단백질의 형광을 보존합니다. 이 기술의 가장 최근의 업데이트인 CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV)은 또한 형광-표지된 항체 및 DNA 표지28을 사용하여 에피토프의 검출을 허용한다.

본 프로토콜에서, 정제된 무손상 마우스 조직에서 형광 단백질을 발현하는 T. cruzi 를 검출하기 위한 CUBIC 파이프라인을 사용하였다. 광학적으로 투명한 조직을 LSFM 이미지화하고 3D로 재구성했으며 장기 당 T. cruzi 감염 세포, 휴면 무명 및 T 세포의 정확한 총 수를 자동으로 정량화했습니다. 또한, 이 프로토콜은 항체 및 핵 얼룩이 있는 투명화된 장기의 균일한 표지를 얻기 위해 성공적으로 채택되었습니다. 이러한 접근법은 감염된 숙주에서 T. cruzi 의 확장 및 제어를 이해하는 데 필수적이며 샤 가스 병에 대한 화학 및 면역 치료제를 완전히 평가하는 데 유용합니다.

Protocol

이 연구는 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책 및 실험실 동물 관리 인증 지침의 평가 및 인증 협회에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 동물 사용 프로토콜(마우스의 T. cruzi 감염 통제-A2021 04-011-Y1-A0)은 조지아 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 나6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J 및 C57BL/6…

Representative Results

CUBIC 고정 조직을 PBS로 세척하여 고정액을 제거한 다음 조직에서 색소와 지질을 추출하는 아미노 알코올의 기본 완충 용액인 CUBIC-L 칵테일과 함께 배양하여 조직 구조를 유지하면서 조직을 탈색시켰습니다. 종이의 격자 선은 장기의 적절한 청소를 나타내는 조직을 통해 볼 수 있습니다 (그림 2A). 탈지화 후, 조직을 세척하고, RI 균질화 및 이미징을 위한 CUBIC-R+ 및…

Discussion

기생충과 면역 반응에 대한 광범위한 전체 장기 영상의 부재는 숙주-기생충 상호 작용의 복잡성에 대한 이해를 제한하고 샤가스병에 대한 치료법의 평가를 방해합니다. 본 연구는 T. cruzi에 감염된 마우스의 손상되지 않은 장기와 조직을 명확히하고 염색하기 위해 CUBIC 파이프 라인을 채택했습니다.

이 연구에서 여러 조직 투명화 프로토콜이 테스트되었습니다 (PACT<sup cl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

조직 투명화 및 면역염색 프로토콜에 관한 귀중한 도움과 권장 사항에 대해 Etsuo Susaki 박사에게 감사드립니다. 또한 LSFM 및 컨포칼 이미징을 사용한 기술 지원에 대해 CTEGD Biomedical Microscopy Core의 M. Kandasamy에게 감사드립니다. 또한이 연구 전반에 걸쳐 유용한 제안을 해주신 Tarleton Research Group의 모든 구성원에게 감사드립니다.

Materials

1-methylimidazole Millipore Sigma 616-47-7
2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine TCI D1876
6-wells cell culture plates ThermoFisher Scientific 140675
AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment Jackson Immuno Research Laboratories 315-607-003
AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment Jackson Immuno Research Laboratories 111-607-003
anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 Chromotek gb2AF647-50
anti-RFP Rockland 600-401-379
anti-α-SMA Sigma A5228
B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse The Jackson Laboratory Strain #007914 Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse The Jackson Laboratory Strain #007914 Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D
BOBO-1 Iodide ThermoFisher Scientific B3582
Bovine serum albumin (BSA) Sigma #A7906
C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse The Jackson Laboratory Strain #032080 Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)
CAPSO Sigma #C2278
Cleaning wipes Kimwipes  Kimberly-Clark T8788
Confocal Laser Scanning Microscope Zeiss LSM 790
CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit TCI C3699
CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit TCI C3698
CUBIC-L TCI T3740
CUBIC-P TCI T3782
CUBIC-R+ TCI T3741
Cyanoacrylate-based gel superglue Scotch 571605
DiR (DiIC18(7); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium Biotium #60017
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) Millipore Sigma 60-00-4
Falcon Centrifuge tubes 15 mL Corning CLS430791
Falcon Centrifuge tubes 50  mL Corning CLS430290
Formalin Sigma-Aldrich HT501128
Heparin ThermoFisher Scientific J16920.BBR
Hyaluronidase Sigma #H3884 or #H4272
Imaris File Converter x64 BitPlane v9.2.0
Imaris software BitPlane v9.3
ImSpector software LaVision BioTec, Miltenyi Biotec v6.7
Intravenous injection needle 23-G Sartori, Minisart Syringe filter 16534
Kimwipes lint free wipes
Light-sheet fluorescent microscope Miltenyi Biotec ULtramicroscope II imaging system
Methanol ThermoFisher Scientific 041838.K2
Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL Axygen T-300, T-200-Y and T-1000-B
Motorized pipet dispenser Fisher Scientific, Fisherbrand 03-692-172
Mounting Solution TCI M3294
N-butyldiethanolamine TCI B0725
Nicotinamide TCI N0078
N-Methylnicotinamide TCI M0374
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 14190-094
RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain Biotium #40061
Sacrifice Perfusion System Leica 10030-380
Scissors Fine Science Tools 91460-11
Serological pipettes Costar Sterile 4488
Shaking incubator TAITEC BR-43FM MR
Sodium azide (NaN3) ThermoFisher Scientific 447815000
Sodium carbonate (Na2CO3) ThermoFisher Scientific L13098.36
Sodium Chloride (NaCl) ThermoFisher Scientific 447302500
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) ThermoFisher Scientific 014707.A9
SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S7020
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

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Sanchez-Valdez, F., Padilla, Á. M., Bustamante, J. M., Hawkins, C. W. D., Tarleton, R. L. Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs. J. Vis. Exp. (184), e63919, doi:10.3791/63919 (2022).

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