컴퓨터 수치 제어 자기 나노 입자 기반 면역 분석에 대한 엇갈린 제한이있는 미세 유체 아크릴 장치의 마이크로 밀링
Summary
미세 유체 공학은 진단 테스트 개발을위한 강력한 도구입니다. 그러나 값비싼 장비와 재료, 힘든 제조 및 취급 기술이 필요한 경우가 많습니다. 여기에서는 저비용 및 사용이 간편한 환경에서 자성 마이크로 및 나노 입자 기반 면역 분석을위한 아크릴 미세 유체 장치의 제조 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.
Abstract
미세 유체 시스템은 면역 분석 기술을 크게 향상 시켰습니다. 그러나 많은 미세 가공 기술에는 전문적이고 비싸거나 복잡한 장비가 필요하므로 제조 비용이 많이 들고 대량 생산과 양립 할 수 없으며, 이는 자원이 부족한 환경에서 현장 진료 테스트 (POCT)를 채택하기위한 가장 중요한 전제 조건 중 하나입니다. 이 작업은 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 마이크로 밀링 기술을 사용하여 나노 입자 접합 효소 면역 분석 테스트를위한 아크릴 (폴리 메틸 메타 크릴 레이트, PMMA) 장치의 제조 공정을 설명합니다. 미세유체 장치의 기능은 100 nm 자성 나노입자에 접합된 모델 항원으로서 라이소자임을 사용하여 상용 항체를 검출하기 위한 면역검정을 수행함으로써 나타난다. 이 장치는 높이가 5μm에 불과한 물리적 엇갈린 제한을 통합하여 외부 자석을 배치하여 자기 트랩을 구성하는 자성 미세 입자를 포착하는 데 사용됩니다. 이러한 방식으로, 공액 나노 입자의 면역 지지체에 대한 자기력은이를 포착하고 유동 항력에 저항하기에 충분합니다. 이 미세유체 장치는 면역분석 성능을 위한 정밀도의 손실 없이 저비용 대량 생산에 특히 적합합니다.
Introduction
최근 몇 년 동안 미세 유체 공학은 면역 분석 기술1에서 중요한 역할을했습니다. 소형화 기술은 기존 면역분석법에 비해 시료 및 시약 소비 감소, 배양 시간 단축, 효율적인 용액 교환, 높은 통합및 자동화 2와 같은 많은 뛰어난 이점을 가지고 있습니다.
또한, 면역 분석의 미세 유체 시스템은 면역 지원체로서 자성 나노 입자와 결합하여 배양 시간을 상당히 단축시켜 증가 된 표면 대 부피 비율로 인해 높은 검출 감도를 달성합니다3. 입자의 브라운 운동은 항원-항체 복합체 4,5의 형성 동안 반응 동력학을 향상시킵니다. 또한, 나노입자의 자기적 특성은 다양한 미세유체 장치 구성에 통합될 수 있는 다기능성을 제공하여 소형화된 온칩 바이오감지 시스템5에서 신호 전달 및 분자 포획에 이상적인 후보가 됩니다. 그러나, 자기력은 높은 표면 대 부피 비율6로 인해 나노 미터 규모의 항력보다 현저히 약하다. 따라서 세척 및 검출과 같은 중요한 면역 분석 단계를 위해 나노 입자를 포획하는 것은 어려울 수 있으며 기존의 자석으로는 충분하지 않습니다4.
나노입자를 조작하는 효율적인 방법은 미세유체 구조(3)로 포장되어 있는 철 미세입자에 의해 형성된 미세유체 자기 트랩을 사용하는 것이다. 따라서 외부 자석이 접근하면 자화된 다공성 매질 내에서 자기력과 자속력 사이에 복잡한 상호 작용이 생성됩니다. 나노 입자에 작용하는 자기력은이를 포착하고 유동 항력 3,4,7에 저항 할만큼 충분히 강합니다. 이 접근법은 마이크로 입자를 유지하는 마이크로 메트릭 구조를 생성하기 위해 몇 마이크로 미터 정도의 해상도를 달성하는 미세 가공 기술이 필요합니다.
현재의 미세가공 기술은 수 미크론에서 수백 나노미터까지의 구조물의 고해상도 제조를 가능하게 한다(8). 그러나 이러한 기술 중 상당수는 전문적이고 비싸거나 복잡한 장비가 필요합니다. 주요 어려움 중 하나는 금형 제작을위한 클린 룸에 대한 요구 사항으로, 비용과 시간이 많이 소요됩니다 8,9. 최근에, 미세유체 공학자들은 비용 절감, 더 빠른 처리 시간, 더 저렴한 재료 및 도구,향상된 기능성 8과 같은 다양한 이점을 갖는 다양한 대체 제조 방법을 개발함으로써 이러한 단점을 극복하고 있다. 이러한 방식으로 새로운 미세 가공 기술의 개발은 10 μm8의 낮은 분해능을 달성하는 저비용의 비 클린 룸 방법을 가져 왔습니다. 패터닝은 값비싼 성형 패턴을 생성하지 않고 기판 상에 직접 사용할 수 있으므로 시간이 많이 소요되는 공정을 피할 수 있습니다. 직접 제조 방법에는 CNC 밀링, 레이저 제거 및 직접 리소그래피8이 포함됩니다. 이러한 모든 방법은 경도9에 관계없이 광범위한 재료에서 높은 종횡비 채널을 생성하는 데적합하며, 미세유체 장치8에서 새롭고 유리한 형상, 물리적 거동 및 품질을 가능하게 합니다.
CNC 마이크로 밀링은 기판에서 벌크 재료를 제거하는 절삭 공구를 사용하여 마이크로 스케일 구조를 생성하며 미세 유체 장치(10,11)를위한 효과적인 제조 방법입니다. 마이크로밀링 기술은 미세 유체 응용 분야에서 작업 표면에 직접 마이크로 채널과 피처를 생성하는 데 유용할 수 있으며, 주요 이점을 제공합니다: 짧은 시간(30분 미만)에 공작물을 제작할 수 있어 설계에서 프로토타입12까지의 처리 시간을 크게 단축할 수 있습니다. 또한 다양한 재료, 크기 및 모양의 절단 액세서리를 광범위하게 사용할 수 있기 때문에 CNC 밀링 머신은 다양한 유형의 저비용 일회용 재료에서 다양한 기능을 제작할 수 있는 적합한 도구입니다13.
마이크로 밀링에 일반적으로 사용되는 모든 재료 중에서 열가소성 수지는 많은 유리한 특성과 생물학적 응용 분야와의 호환성10,14로 인해 선도적 인 선택으로 남아 있습니다. 열가소성 수지는 저비용의 일회용분석 시스템 9 개발에 상당한 이점이 있기 때문에 미세 유체 시스템에 매력적인 기질입니다. 또한 이러한 재료는 대량 제조 공정에 매우 적합하여 상업화 및 대량 생산에 적합합니다. 이러한 이유로 PMMA와 같은 열가소성 수지는 미세 유체 공학10의 초기부터 신뢰할 수 있고 견고한 재료로 간주되었습니다. 열가소성 수지에서 폐쇄 채널을 제조하기 위한 상이한 프로토콜이 설명되었으며, 예컨대 용매 접합(15), 열 접합(16) 및 자외선(UV)/오존 표면 처리 접합(17)이 있다.
많은 경우, 기존의 마이크로 밀링 머신으로 달성 된 위치 결정 분해능은 10 μm보다 작은 구조가 필요한 일부 미세 유체 응용 분야에는 충분하지 않습니다. 고급 마이크로 밀링은 충분한 분해능을 가지고 있습니다. 불행히도, 높은 가격으로 인해, 그 사용은 소수의 사용자로 제한됩니다12. 이전에 우리 연구 그룹은 10μm 미만의 가공 구조를 허용하는 저비용 공구의 제조 및 조작을 보고하여 기존 밀링 머신의 분해능을 극복했습니다12. 고정 장치는 3 개의 압전 액추에이터를 포함하는 간단한 전자 장치로 3D 인쇄로 제조 된 플랫폼입니다. 표면에는 압전 요소가 동시에 작용할 때 들어 올릴 수있는 힌지 모양의 조인트가 있습니다. Z축 변위는 500nm의 분해능과 ±1.5μm의 정확도로 제어할 수 있습니다12.
이 논문은 마이크로 밀링 기술을 통한 아크릴 장치 (PMMA)의 제조 공정 단계를 제시합니다. 칩 설계는 폭 200μm, 높이 200μm의 메인 채널과 시약의 흐름을 퍼지하기 위한 동일한 치수의 측면 채널로 구성됩니다. 중앙 영역에서, 채널은 외부 자석을 배치하여 나노 입자의 자기 트랩을 구성하는 자성 미세 입자를 포착하기 위해이 그룹(12)에 의해 만들어진 3D 인쇄 압전 플랫폼으로 제작 된 높이가 5μm에 불과한 물리적 제한에 의해 중단됩니다. 우리는 100 nm 자성 나노 입자에 접합 된 모델 항원으로 라이소자임을 사용하여 상용 항체를 검출하기위한 면역 분석법을 수행하여 미세 유체 장치의 작동을 보여줍니다. 이 장치는 독특한4 : 면역 지원으로 자성 나노 입자를 사용하면 총 테스트 시간이 몇 시간에서 몇 분으로 단축됩니다. 검출을 위해 형광 생성 효소를 사용하면 표준 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)과 비교할 수있는 검출 한계가 허용됩니다. 그리고 열가소성 수지를 제조 재료로 사용하면 이전 미세 유체 나노 입자의 자기 트랩3에는 없었던 대량 생산과 호환되며 POCT를 개발할 수있는 훌륭한 후보가됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
나노입자를 면역지지체로서 사용하는 면역분석용 아크릴 미세유체 장치를 마이크로밀링 기술을 사용하여 제작하였다. 기판 상에 직접 제조하는 방법은 마스터 몰드의 사용과 이것이 의미하는 시간 및 비용을 피할 수 있는 장점이 있다. 그러나 신속한 프로토 타이핑 및 대량 장치 제조로 제한됩니다.
여기에서, 우리는 밀링 머신(12)에 대해 이전에보고 된 액?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 “Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación”의 보조금 312231 따라 멕시코 Conacyt와 AMEXCID 및 멕시코 외교부 (SRE)가 “Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2″보조금으로 지원했습니다. JAHO는 박사 학위 장학금에 대해 Conacyt Mexico에 감사드립니다.
Materials
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008×1/8×0.12×1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032×1/8×0.48×1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate – Sheet – PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
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