Mycobacterium tuberculosis Ekstracellulær vesikkelberikelse gjennom størrelsesekskluderingskromatografi

Frigjøring av ekstracellulære vesikkel (EV) av patogener kan være nøkkelen til å låse opp ny teknologi for å kontrollere smittsomme sykdommer¹. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) er et patogen av høy konsekvens, infiserer omtrent en tredjedel av verdens befolkning og krever livet til millioner av mennesker hvert år². EV-produksjon av Mtb er godt dokumentert, men likevel unnvikende i biogenesen og varierte roller (dvs. immunostimulerende, immunosuppressiv, jern og næringsoppkjøp) av disse EV-ene i forbindelse med infeksjon ^3,4,5. Forsøk på å forstå sammensetningen av Mtb EV avslørte 50-150 nm lipidmembranlukkede kuler avledet fra plasmamembranen som inneholder lipider og proteiner av immunologisk betydning ^3,6. Undersøkelse av rollen til MTB EV i bakteriell fysiologi har avslørt betydningen av bakteriell EV-modulering som svar på miljøstress for overlevelse⁵. Host-patogen interaksjonsstudier har vært mer kompliserte å tolke, men bevis indikerer at Mtb EV kan påvirke immunresponsen til verten og potensielt kan tjene som en effektiv vaksinasjonskomponent ^3,4,7.

De fleste studier av MTB-elbiler så langt har basert seg på tetthetsgradient ultrasentrifugering for vesikkelberikelse⁸. Dette har vært effektivt for småskala studier; Denne teknikken har imidlertid flere tekniske og logistiske utfordringer. Alternative arbeidsflyter par multistep sentrifugering, for fjerning av hele celler og store rusk, med en siste ultracentrifugation trinn til pellet EV. Denne metoden kan variere i effektivitet, og resulterer ofte i lavt utbytte og korensing av løselige ikke-vesikkelassosierte biomolekyler samtidig som den påvirker vesikkelategritet⁹. I tillegg er denne prosessen tidkrevende, manuelt intensiv og svært begrenset i gjennomstrømning på grunn av utstyrsbegrensninger.

Denne protokollen beskriver en alternativ teknikk til tetthetsgradient ultrasentrifugering: størrelseseksklusjonskromatografi (SEC). Denne metoden har blitt demonstrert for miljømykobakterier, og i det nåværende arbeidet har den blitt ekstrapolert til Mtb¹⁰. En kommersielt tilgjengelig kolonne- og automatisk fraksjonssamler kan forbedre konsistensen i vesisk forberedelse og redusere behovet for spesifikt, dyrt utstyr. Det er også mulig å fullføre denne protokollen på en brøkdel av tiden sammenlignet med tetthetsgradient ultracentrifugation, noe som øker gjennomstrømningen. Denne teknikken er mindre teknisk utfordrende, noe som gjør det lettere å mestre, og kan øke inter / intra-laboratoriet reproduserbarhet. Endelig har SEC høy separasjonseffektivitet og er mild, og bevarer vesiklernes integritet.