仓鼠卵巢细胞的快速抗体糖工程

1. DsiRNA设计与重构 使用 Safari、Firefox 或 Microsoft Edge 访问 IDT 网站（https://eu.idtdna.com）。在主页上，选择“产品和服务 ”选项卡，然后选择 RNA 干扰。要生成靶向 Fut8 基因的自定义干燥器底物 （DsiRNA） 构建体，请选择 “设计”工具 ，然后选择“ 生成自定义 DsiRNA ”选项卡。 输入 Fut8 加入号或手动输入基因序列即可开始。在这项研究中，从 https://chogenome.org 获得来自“CHO-K1”和“中国仓鼠”条目的 Fut8 序列，并用于产生DsiRNA。大多数基因都有几个转录本变异，重要的是要验证DsiRNA在当前组装中的所有报告变异上是否活跃。 选择执行“手动 BLAST”搜索的选项，因为 CHO 细胞基因组目前在 IDT 网站上无法作为“参考基因组”提供。此步骤搜索自定义DsiRNA序列和感兴趣基因组之间的匹配。 单击“ 搜索 ”以生成 DsiRNA 序列。 反过来，使用税号为：10029（CHO细胞系和中国仓鼠）的“手动BLAST”功能评估每种DsiRNA的特异性。查询覆盖率结果表明，DsiRNA构建体与 Fut8 （包括 Fut8 转录本变体）的匹配度为100%，而对非预期靶标的互补性为≤76。 检查DsiRNA是否专门针对 Fut8 ，以确保GC含量在30%-50%之间。低GC含量与弱和非特异性结合有关，而高GC含量抑制siRNA放卷并加载到RISC复合物36中。 选择三种DsiRNA用于转染研究（表1），每种都针对 Fut8 基因的不同位置。从 IDT 购买预先设计的非靶向或加扰 DsiRNA 进行对照实验。 到达后，将DsiRNA以13，300×g离心1分钟至沉淀，然后打开管。将无核酸酶双链缓冲液（由IDT提供）中的每种冻干DsiRNA重构到100μM储备溶液中。例如，将20μL缓冲液加入2nmol DsiRNA中以获得100μM储备液。 为确保充分混合，将储备溶液在室温下孵育30分钟，同时在轨道振荡器（50 rpm，16 mm轨道）上轻轻摇动。 通过结合20μL靶向 Fut8 的每种DsiRNA构建体（每个DsiRNA的100μM）来创建预混液。准备等分试样并储存在-20°C。 DsiRNA靶标 序列 气相色谱（%） 结构 A 5′ 嘎嘎 36% 5′ 咕 结构 B 5′ 阿加奥加奥高乌克特 3′ 32% 5′ 阿加阿卡奥库库乌库加 3′ 结构 C 5′ 阿加嘎 32% 5′ 瓜乌加库乌库 3′ 表 1.用于 Fut8 敲低的DsiRNA序列。 IDT生成的靶向中国仓鼠和CHO K1细胞基因组中 Fut8 的序列。分别显示每个构造的检测和反义序列，并显示每个结构的 GC 内容。转载自Kotidis等人。52. 2. DsiRNA转染 使用适合目标细胞系的培养条件恢复表达IgG单克隆抗体37 的CHO细胞。注意：本研究中使用的细胞是使用谷氨酰胺合成酶（GS）系统生成的，其中内源性GS被L-蛋氨酸磺酰肟（MSX）抑制，以增强稀有高产克隆的选择。因此，仅当所选细胞系需要时才使用MSX。 在设置为37°C的水浴中解冻一小瓶细胞2-3分钟。 用70%（v / v）乙醇清洁小瓶外部，并在II类生物安全柜中继续所有工作。 将细胞悬浮液转移到含有9 mL预热培养基的15 mL离心管中，该培养基适合所选细胞系。通过以100×g离心5分钟沉淀细胞。 小心地去除并丢弃培养基，而不干扰细胞沉淀。然后，将细胞沉淀重悬于10mL预热培养基中，并取等分试样进行计数。 如果用血细胞计数器计数，则用台盼蓝染色细胞，或者在使用自动细胞计数器时用适当的染色剂来区分活细胞/死细胞。 遵循任一列举方法，将适当体积的细胞悬浮液转移到125 mL锥形瓶中，活细胞密度为3 x 105 cell·mL-1 ，在30 mL培养基中（可选补充50μM MSX）。 将细胞转移到设置为36.5°C，5%CO2 的培养箱中，并以150rpm（16 mm轨道）置于振荡平台上。 在250 mL锥形瓶中以2×105 细胞·mL-1 的接种密度和50mL的工作体积每3-4天传代一次细胞。如果使用MSX，请在第一次传代后停止补充。 传代细胞2x除解冻。 转染 评估细胞密度，确保细胞活力大于90%。 用70%（v / v）乙醇和RNase抑制剂溶液仔细清洁生物安全柜和所有设备，以避免污染。 以100×g沉淀细胞5分钟，重悬于预热培养基中至活细胞密度为5×106 个细胞·mL-1。 将8μL（相当于1μM）DsiRNA预混液或对照转移到无菌（0.4cm）电穿孔比色皿中。然后，将800μL细胞悬浮液（相当于4×106 个细胞）转移到同一比色皿中，并确保两种组分混合。 提供以下脉冲条件：1200 V、0.1 ms、方波。 将细胞悬浮液从比色皿转移到6孔板的一孔中，注意避免泡沫状材料。在培养箱（36.5°C，5%CO2）中回收细胞，而无需摇动10分钟。 加入800μL预热培养基，使最终体积达到每孔1.6mL，并将转染的细胞返回到培养箱中进行生长（36.5°C，5%CO2），同时以150rpm（16mm轨道）振荡。 转染后48小时收获上清液和细胞。停止点：细胞培养上清液可保持在-20°C;然而，建议在细胞沉淀收集后立即进行细胞裂解，以避免蛋白质降解。上清液用于步骤3，步骤4和步骤5，而细胞沉淀用于步骤6。 3. IgG定量纯化 使用生物层干涉测量法或其他选择的方法测量IgG浓度。 在样品稀释剂中水合蛋白A生物传感器尖端10-30分钟。同时，将细胞悬浮液转移到15 mL离心管中，并以100×g沉淀细胞5分钟，或通过0.45μm硝酸纤维素过滤器过滤除去细胞。 在不干扰沉淀的情况下，小心地将含有IgG的分离上清液转移到干净的离心管中。 使用以下设置进行生物层干涉测量：振荡器速度，2200 rpm;运行时间，60 秒。这些参数将用于测量所有样品和对照。 一旦生物传感器尖端被水合，使用IgG标准品（每种浓度的4μL）创建标准曲线。 通过上样4μL细胞上清液定量样品浓度。在每个样品之间用无绒擦拭布清洁设备。 将标准曲线链接到未知样品，以插值未知样品的结合速率。保存数据并导出为 csv 或 PDF 文件。 免疫球蛋白纯化 制备含有0.2M甘氨酸（pH 2.5）的洗脱缓冲液，并通过0.22μm过滤器灭菌。 在室温下使用0.22μm微量离心机过滤管过滤1mL分离的上清液，直到整个上清液流过。 在1.5mL离心管中沉淀150-200μL蛋白A琼脂糖珠，以100×g离心3分钟并弃去上清液。然后，用150-200μL细胞培养基洗涤蛋白质A珠并重复离心。弃去上清液。 将平衡蛋白A珠与步骤3.2.3中制备的1mL上清液重悬。并装入1 mL聚丙烯管中。将聚丙烯管固定在旋转混合器（15 mm轨道）上，并在室温下以30rpm旋转60-90分钟或在4°C下过夜。 孵育完成后，收集流通物并用1 mL 1x PBS洗涤磁珠以除去任何未结合的蛋白质。同时收集洗涤部分。 通过在聚丙烯柱中加入3mL洗脱缓冲液，从蛋白质A珠中洗脱IgG。收集从色谱柱（每个500 μL）排出到标记管中的顺序级分。 可选：如果要储存纯化的抗体，请通过添加25μL 1 M Tris pH 9.5来中和洗脱缓冲液。如果抗体将通过缓冲液交换等立即处理，请跳过此步骤。注意：纯化的所有部分（流通，洗涤和所有洗脱部分）应保持保持，以确保目标蛋白不会丢失。如果纯化不成功，这些样品也可以在故障排除过程中提供帮助。 使用第一次洗脱（洗脱液A）进行下游处理，但如果将来需要，请保留所有其他馏分。 4. 缓冲液更换和样品浓缩 将IgG洗脱缓冲液与1x PBS交换。 将洗脱液A加载到3 kDa分子量截止离心浓缩器上。选择合适的 MWCO 色谱柱时，请参阅制造商指南。在该实验中，较小的孔径确保了分泌蛋白质的最大保留，但也增加了离心时间。 在4°C下以13，300×g离心40-50分钟。 一旦残余体积等于或小于50μL，离心就完成了。 弃去流通液并加入500μL预稠化（4°C）1x PBS以稀释残留的上清液。使用相同的条件（13，300×g在4°C下40-50分钟）再次离心样品，直到残留50μL残留上清液。 加入500μL预沸（4°C）1x PBS以稀释残留的上清液，并再次重复离心过程以获得100x稀释的上清液。 将上清液浓缩至终浓度~2.5 g·L-1 在40μL或更低，以确保与聚糖分析方法的相容性。注意：需要加载100μg用于聚糖分析。停止点：浓缩的IgG（1x PBS）可以在-20°C下储存，并在聚糖分析之前解冻。 5. 聚糖分析 根据制造商的说明使用毛细管凝胶电泳进行聚糖分析。 将200μL磁珠溶液转移到0.2mL PCR管中，并置于磁性支架上以将磁珠与上清液分离。 小心地除去上清液，并从磁性支架上取出管子。加入纯化的蛋白质样品和涡旋，以确保完全混合。 将变性缓冲液（提供）加入样品管中，并在60°C下孵育8分钟。 保持样品管打开，以获得最佳反应性能。 加入PNGase F（每个样品500单位）并在60°C下孵育20分钟以从纯化的抗体中切割聚糖。 在释放N-聚糖后，关闭样品管并涡旋。加入乙腈，涡旋，并在室温下孵育1分钟。 将样品管放在磁性支架中，以将磁珠与溶液分离。使用移液器小心地除去上清液，不要接触珠子。 在通风橱中，将含有荧光团的聚糖标记溶液加入样品中。涡旋以确保充分混合并在60°C下孵育20分钟（打开盖子）。 将样品在乙腈中洗涤3次以除去多余的染料。然后，在DDI水中洗脱标记的聚糖（供应）。 将样品管置于磁性支架中，以将珠子与含有纯化和标记聚糖的上清液分离。 准备葡萄糖梯标准品，包围标准品和样品并将其装载到指定的托盘位置。运行聚糖分析方案。 使用适当的软件来分析和鉴定样品中存在的聚糖。注意：确保加热块中的温度准确，以实现高效孵育。 6. 免疫印迹 使用抗α-1，6-岩藻糖基转移酶抗体进行蛋白质印迹分析，量化敲低效率。聚丙烯酰胺凝胶和缓冲液配方可从38，39商业供应商处获得。 在转染后48小时，使用血细胞计数器或自动细胞计数器计数细胞，并确定相当于5×106 个细胞的细胞悬浮液体积。 将适当体积的细胞悬浮液从每个实验条件转移到无菌的1.5mL离心管中，并在4°C下以13，200×g沉淀10分钟。 弃去上清液。 在室温下用含有1%v / v蛋白酶抑制剂混合物的200μL裂解缓冲液（适用于从哺乳动物细胞中提取蛋白质）裂解细胞10分钟。在孵育期间轻轻摇动混合物（50rpm，16 mm轨道）。 为了除去细胞碎片，将裂解物以13，200×g离心10分钟，然后将清除的裂解物转移到无菌的1.5mL管中。 使用280nm处的分光光度计测量每种裂解物的蛋白质浓度。随后，制备调整为具有相同蛋白质浓度的每种样品的等分试样。 通过在DTT-SDS样品上样染料中在100°C下孵育10-15分钟使蛋白质样品变性;最终染料浓度为1x。 将15μL变性样品和5μL预染蛋白分子量标准品上样到具有12.5%分辨凝胶的SDS-PAGE凝胶中，以实现高效分离。以每块凝胶25 mA的电流运行样品90分钟或直到染料前端到达凝胶的末端。 小心地从凝胶盒中取出凝胶，并在含有甲醇的1x转膜缓冲液中孵育。 准备湿转印系统并用甲醇激活PVDF膜。组装凝胶和PVDF膜进行湿转印，在转印罐中放置一个冰块，并将整个转印槽浸没在冰中以确保转印条件保持低温。在 350 mA/100 V 下运行 60 分钟。 通过在室温下在封闭溶液中孵育30分钟来阻断膜，同时在轨道振荡器上以50rpm（16mm轨道）轻轻摇动。 用无菌水冲洗膜5分钟并重复。然后，使用干净的手术刀以〜50 kDa的速度小心地水平切割膜，使用可见的蛋白质分子量标准作为指导。 将含有大于50 kDa的蛋白质的膜与抗α-1，6-岩藻糖基转移酶抗体在抗体稀释剂缓冲液中以1：1000孵育。在稀释剂缓冲液中用小于50 kDa的固定化蛋白质孵育膜，并在1：10，000处具有抗GAPDH。膜可以在室温下孵育1小时或在4°C下过夜。 洗涤膜5分钟（x3），然后在室温下与适当的二抗一起孵育至少30分钟。 用洗涤缓冲液进行3次洗涤5分钟，然后用水洗涤3次。然后，用显色底物（或适当的检测试剂）显影膜，直到条带出现（1-60分钟）。 用水冲洗膜2次，然后让其干燥。捕获膜的图像并执行密度分析40。 要计算每个样品中的相对蛋白表达，首先计算样品中GAPDH信号的比率。这是每个样本的归一化因子，用于校正样本加载量的差异。 将 FUT8 信号强度（对于每个泳道）除以相应泳道的归一化因子，得到相对 FUT8 蛋白表达。