קידום הדמיה ברזולוציה גבוהה של מכלולי וירוסים בנוזלים ובקרח
Summary
כאן מתוארים פרוטוקולים להכנת מכלולי וירוסים המתאימים לניתוח נוזל-EM וקריו-EM בקנה מידה ננומטרי באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה.
Abstract
העניין במיקרוסקופיה של אלקטרונים נוזליים (liquid-EM) הרקיע שחקים בשנים האחרונות כאשר מדענים יכולים כעת לצפות בתהליכים בזמן אמת בקנה מידה ננומטרי. רצוי מאוד להתאים מידע cryo-EM ברזולוציה גבוהה עם תצפיות דינמיות כמו אירועים רבים מתרחשים על צירי זמן מהירים – בטווח של אלפית השנייה או מהר יותר. ידע משופר על מבנים גמישים יכול גם לסייע בתכנון ריאגנטים חדשים כדי להילחם בפתוגנים מתפתחים, כגון SARS-CoV-2. חשוב מכך, צפייה בחומרים ביולוגיים בסביבה נוזלית מספקת הצצה ייחודית לביצועיהם בגוף האדם. מוצגות כאן שיטות שפותחו לאחרונה כדי לחקור את התכונות הננומטריות של מכלולי וירוסים בקרח נוזלי וזגוגי. כדי להשיג מטרה זו, דגימות מוגדרות היטב שימשו כמערכות מודל. מוצגות השוואות זו לצד זו של שיטות הכנת המדגם ומידע מבני מייצג. תכונות תת-ננומטר מוצגות עבור מבנים שנפתרו בטווח של ~3.5-Å-10 Å. תוצאות עדכניות אחרות התומכות במסגרת משלימה זו כוללות תובנות דינמיות של מועמדים לחיסון וטיפולים מבוססי נוגדנים המצולמים בנוזל. באופן כללי, יישומים קורלטיביים אלה מקדמים את היכולת שלנו לדמיין דינמיקה מולקולרית, ומספקים הקשר ייחודי לשימוש בהם בבריאות האדם ובמחלות.
Introduction
המחקר הביו-רפואי משפר את הבנתנו את בריאות האדם ומחלותיו באמצעות פיתוח טכנולוגיות חדשות. הדמיה ברזולוציה גבוהה משנה את השקפתנו על עולם הננו – ומאפשרת לנו לחקור תאים ומולקולות בפירוט רב 1,2,3,4,5. מידע סטטי של רכיבים דינמיים כגון פולימרים רכים, מכלולי חלבונים או וירוסים אנושיים חושף רק תמונת מצב מוגבלת של הנרטיב המורכב שלהם. כדי להבין טוב יותר כיצד ישויות מולקולריות פועלות, יש לחקור במשותף את המבנה והתפקוד שלהן.
ההתקדמות האחרונה בייצור חומרים כגון גרפן דק אטומית או שבבים מבוססי סיליקון מספקת הזדמנויות חדשות לניתוח מבנה-תפקוד בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופי אלקטרונים (TEMs). חומרים אלה יכולים ליצור תאים אטומים הרמטית להדמיית EM חיה 6,7,8,9,10,11. התחום החדש של liquid-EM, טמפרטורת החדר בקורלציה לקריו-EM, מספק תצוגות חסרות תקדים של חומרים קשים או רכים בתמיסה, ומאפשר למדענים לחקור בו זמנית את המבנה והדינמיקה של הדגימה שלהם. יישומי Liquid-EM כוללים הקלטות בזמן אמת של ננו-חלקיקים טיפוליים המקיימים אינטראקציה עם תאי גזע סרטניים, כמו גם שינויים במורכבות המולקולרית של פתוגנים נגיפיים12,13,14.
בדיוק כפי שההתקדמות המתודולוגית דרבנה את מהפכת הפתרון בתחום הקריו-EM, יש צורך בטכניקות ושיטות חדשות כדי להרחיב את השימוש ב-liquid-EM ככלי בעל תפוקה גבוהה עבור הקהילה המדעית. המטרה הכוללת של השיטות המוצגות כאן היא לייעל את פרוטוקולי ההכנה של דגימות Liquid-EM. הרציונל מאחורי הטכניקות שפותחו הוא שימוש בעיצובי שבבים חדשים ובהתקני טעינה אוטומטית, המתאימים הן לאיסוף נתונים נוזליים והן לאיסוף נתונים קריו-EM (איור 1)7,14,15,16,17. המכלולים אטומים מכנית באמצעות תפסי רשת סטנדרטיים עבור מכשירים אוטומטיים, כגון ה-Krios, שיכולים להכיל דגימות מרובות בכל סשן או F200C TEM (איור 2). מתודולוגיה זו מרחיבה את השימוש בהדמיה ברזולוציה גבוהה מעבר ליישומי cryo-EM סטנדרטיים המדגימים מטרות רחבות יותר לניתוח חומרים בזמן אמת.
במאמר הווידאו הנוכחי מוצגים פרוטוקולים להכנת מכלולי וירוסים בנוזל עם ובלי מחזיקי דגימה זמינים מסחרית. באמצעות מחזיק הדגימה המיוחד עבור liquid-EM, דגימות נוזליות דקות יכולות לספק מידע מבני הדומה לדגימות cryo-EM, כמו גם תובנות דינמיות של הדגימות. כמו כן הודגמו שיטות להכנת דגימות נוזליות באמצעות כלי autoloader עבור שגרות תפוקה גבוהה. היתרון העיקרי על פני טכניקות אחרות הוא שייצור דגימות אוטומטי מאפשר למשתמש להעריך במהירות את הדגימות שלו עבור עובי אופטימלי ומינון אלקטרונים לפני איסוף הנתונים. טכניקת סינון זו מזהה במהירות אזורים אידיאליים להקלטות בזמן אמת בנוזל או בקרח12,14,18,19. לצורך קביעת מבנה תלת-ממדי, Liquid-EM עשוי להשלים את שיטות cryo-EM הוותיקות המיושמות ב- cryo-EM. קוראים המשתמשים בטכנולוגיות TEM או cryo-EM קונבנציונליות עשויים לשקול להשתמש בזרימות עבודה של Liquid-EM כדי לספק תצפיות חדשות ודינמיות של הדגימות שלהם באופן המשלים את האסטרטגיות הנוכחיות שלהם.
דגימות וירוסים המשמשות בפרוטוקול זה כוללות תת-סוג וירוס מטוהר הקשור לאדנו 3 (AAV) שהושג במתנה ותורבית בתנאים סטנדרטיים12. כמו כן נעשה שימוש במכלולים תת-ויראליים לא זיהומיים של SARS CoV-2 שמקורם בסרום של חוליCOVID-19 12 והתקבלו ממקור מסחרי. לבסוף, חלקיקים דו-שכבתיים מטוהרים מסוג simian rotavirus (זן SA11) התקבלו ממעבדתה של ד”ר שרה מ. מקדונלד אסתמן באוניברסיטת ווייק פורסט וגודלו בתרבית בתנאים סטנדרטיים 6,17. חבילות התוכנה המתוארות כאן זמינות באופן חופשי והקישורים סופקו בסעיף טבלת חומרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הזדמנויות חדשות מוצגות כדי לייעל את זרימות העבודה הנוכחיות של Liquid-EM על-ידי שימוש בכלים וטכנולוגיות אוטומטיים חדשים המותאמים מתחום cryo-EM. יישומים הכרוכים בטכניקת כריך השבב החדשה הם משמעותיים ביחס לשיטות אחרות מכיוון שהם מאפשרים ניתוח הדמיה ברזולוציה גבוהה בקרח נוזלי או זגוגי. אחד השלבים ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לד”ר לוק ה. ונדנברגה (בית הספר לרפואה של הרווארד, המחלקה לרפואת עיניים) על אספקת AAV-3 מטוהר. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות והמכון הלאומי לסרטן (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 עד D.F.K.).
Materials
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10×10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
References
- Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
- Oikonomou, C. M., Chang, Y. -. W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
- Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
- Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).
- Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
- Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
- Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80 (2018).
- Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).
- Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
- Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
- Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
- Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
- Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
- Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
- Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
- Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
- Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).
