JoVE Journal > Developmental Biology
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Abstract
Introduction
Protocol
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발생학

마우스 안면 과정으로부터 전체 세포 단백질 용해물을 분리하고 포스포단백질 분석을 위해 배양된 팔라탈 중간엽 세포

Published: April 01, 2022
doi:
10.3791/63834
, ,
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine,University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

상기 프로토콜은 해부된 마우스 배아 안면 과정 또는 배양된 마우스 배아 구개 중간엽 세포로부터 전체 세포 단백질 용해물을 단리하고 인산화된 단백질 수준을 평가하기 위해 후속 웨스턴 블롯팅을 수행하는 방법을 제시한다.

Abstract

포유류 두개골 안면 발달은 여러 세포 집단이 전두엽 골격을 생성하기 위해 조정되는 복잡한 형태 학적 과정입니다. 이러한 형태학적 변화는 다양한 신호전달 상호작용을 통해 시작되고 지속되며, 이는 종종 키나아제에 의한 단백질 인산화를 포함한다. 여기에서, 포유동물 두개골 발달 동안 단백질의 인산화를 연구하는 생리학적으로 관련된 맥락의 두 가지 예가 제공된다: 마우스 안면 과정, 특히 E11.5 상악 과정, 및 E13.5 이차 구개 선반으로부터 유래된 배양된 마우스 배아 구개 중간엽 세포. 단백질 분리 중 탈인산화의 공통적 인 장벽을 극복하기 위해 포스포 단백질의 분리를 허용하는 표준 실험실 방법에 대한 적응 및 변형이 논의됩니다. 또한, 전체 세포 단백질 용해물의 웨스턴 블롯팅에 따른 포스포단백질의 적절한 분석 및 정량화를 위한 모범 사례가 제공됩니다. 이러한 기술은, 특히 약리학적 억제제 및/또는 뮤린 유전 모델과 조합하여, 두개골 발달 동안 활성인 다양한 포스포단백질의 역학 및 역할에 대한 더 큰 통찰력을 얻기 위해 사용될 수 있다.

Introduction

포유류 두개골 안면 발달은 여러 세포 집단이 전두엽 골격을 생성하기 위해 조정되는 복잡한 형태 학적 과정입니다. 마우스에서,이 과정은 배아 일 (E) 9.5에서 전두엽 두드러기와 상악 및 하악 과정의 쌍을 형성하면서 시작되며, 각각은 철새 후 두개골 신경 볏 세포를 포함합니다. 측면 및 내측 비강 과정은 비강 구덩이의 출현과 함께 전두엽 두드러짐에서 발생하고 결국 융합되어 콧 구멍을 형성합니다. 또한, 내측 비강 과정과 상악 과정은 상립을 생성하기 위해 융합된다. 동시에, 고형성 (palatogenesis)은 E11.5에서 상악 과정의 구강 측에서 뚜렷한 파생물 (이차 구개 선반)의 형성으로 시작됩니다. 시간이 지남에 따라 구개골 선반은 혀의 양쪽에서 아래쪽으로 자라며 혀 위의 반대 위치로 상승하고 결국 중간 선에서 융합되어 E16.51에 의해 비강과 구강 충치를 분리하는 연속 구개열을 형성합니다.

두개골 안면 발달 전반에 걸친 이러한 형태학적 변화는 다양한 신호전달 상호작용을 통해 시작되고 지속되며, 이는 종종 키나아제에 의한 단백질 인산화를 포함한다. 예를 들어, 골형성 단백질 수용체 (BMPRs) 및 다양한 수용체 티로신 키나제 (RTK) 패밀리를 포함하는 형질전환 성장 인자 (TGF)-β 수용체의 서브패밀리와 같은 세포막 수용체는 두개골 신경 크레스트 세포 2,3,4에서 리간드 결합 및 활성화시 자가인산화된다. . 추가적으로, G 단백질-결합된 막횡단 수용체 평활화는 Patched1 수용체에 결합하는 소닉 헤지호그(SHH) 리간드의 두개골 신경 크레스트 세포 및 두개골 외배엽 하류에서 인산화되어, 섬모막 및 SHH 경로 활성화5에서의 평활화된 축적을 초래한다. 이러한 리간드-수용체 상호작용은 두개골 맥락에서 자가분비, 파라크린, 및/또는 병타크린 신호전달을 통해 발생할 수 있다. 예를 들어, BMP6는 연골세포 분화 6 동안 자가분비 방식으로 신호를 보내는 것으로 알려져 있는 반면, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 8은 인두 아치 외배엽에서 발현되고 인두 아치 중간엽에서 발현되는 RTKs의 FGF 패밀리의 구성원에 결합하여 인두 아치의 패터닝 및 발발을 개시하는 파라크린 방식으로7, 8,9,10. 또한, 노치 신호전달은 막횡단 델타 및/또는 재그드 리간드가 이웃 세포 상의 막횡단 노치 수용체에 결합할 때 juxtacrine 신호전달을 통해 두개골 골격 발달 동안 연골세포 및 조골세포 둘 다에서 활성화되며, 이는 후속적으로 절단되고 인산화된다(11). 그러나, 자가분비 및 파라크린 신호전달 둘 다에서 기능할 수 있는 유연성을 갖는 두개골 발달에 중요한 다른 리간드 및 수용체 쌍이 있다. 일례로서, 뮤린 치아 형태형성 동안, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF)-AA 리간드는 법랑질 기관 상피12에서 RTK PDGFRα를 활성화시키는 자가분비 방식으로 신호를 보내는 것으로 입증되었다. 대조적으로, 임신 중반 동안의 뮤린 안면 과정에서, 리간드 PDGF-AA 및 PDGF-CC를 코딩하는 전사체는 두개골 외배엽에서 발현되는 반면, PDGFRα 수용체는 기저 두개골 신경 볏 유래 중간엽에서 발현되어, 파라크린 신호전달13,14,15,16,17을 초래한다. . 신호전달 메카니즘에 관계없이, 이러한 수용체 인산화 사건은 종종 어댑터 단백질 및/또는 신호전달 분자의 모집을 초래하며, 이는 종종 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK) 경로와 같은 세포내 키나제 캐스케이드를 개시하기 위해 스스로 인산화된다18,19.

이들 캐스케이드의 말단 세포내 이펙터는 이어서 전사 인자, RNA-결합, 세포골격 및 세포외 매트릭스 단백질과 같은 기질의 어레이를 인산화할 수 있다. Runx220, Hand1 21, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 및 Sox9 26은 두개골 안면 발달의 맥락에서 인산화된 전사 인자 중 하나이다. 이러한 번역 후 변형(PTM)은 다른 활동들 중에서도 대안적인 PTM, 이량체화, 안정성, 절단 및/또는 DNA 결합 친화도에 대한 감수성에 직접적으로 영향을 미칠 수 있다(20,21,25,26). 추가적으로, RNA-결합 단백질 Srsf3는 두개골 안면 발달의 맥락에서 인산화되어, 그의 핵 전좌(27)로 이어진다. 일반적으로, RNA-결합 단백질의 인산화는 그들의 세포외 국소화, 단백질-단백질 상호작용, RNA 결합, 및/또는 서열 특이성(28)에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 더욱이, 악토묘신의 인산화는 두개골 발달 전반에 걸쳐 세포골격 재배열(29,30)을 유도할 수 있고, 작은 인테그린 결합 리간드 N-결합 당단백질과 같은 세포외 매트릭스 단백질의 인산화는 골격 발달 동안 생광물화에 기여한다(31). 상기 및 다수의 다른 예를 통해, 두개골 안면 발달 동안 단백질 인산화에 대한 광범위한 함의가 있음이 명백하다. 추가적인 수준의 조절을 추가하면, 단백질 인산화는 포스파타제에 의해 더욱 조절되며, 이는 포스페이트 그룹을 제거함으로써 키나아제를 상쇄시킨다.

수용체 및 이펙터 분자 수준 모두에서 이러한 인산화 사건은 신호전달 경로의 전파에 매우 중요하며, 궁극적으로 핵에서의 유전자 발현의 변화를 초래하여, 이동, 증식, 생존 및 분화와 같은 특정 세포 활동을 유도하여, 포유동물 얼굴의 적절한 형성을 초래한다. 키나제 및 포스파타아제와의 단백질 상호작용의 맥락 특이성, PTM의 결과적인 변화, 세포 활성에 미치는 영향을 고려할 때, 이러한 파라미터가 생리학적으로 관련된 환경에서 연구되어 두개골 발달에 대한 인산화 사건의 기여에 대한 완전한 이해를 얻는 것이 중요하다. 여기에서, 단백질의 인산화 및 따라서 포유동물 두개골 발달 동안 신호전달 경로의 활성화를 연구하는 두 가지 맥락의 예가 제공된다: 마우스 안면 과정, 특히 E11.5 상악 과정, 및 배양된 마우스 배아 구개 중간엽 세포 E13.5 이차 구개 선반으로부터 유래 – 일차32차 및 불멸화33 둘 다 . E11.5에서, 상악 과정은 측방 및 내측 비강 과정1과 융합하는 과정에 있으며, 이로써 마우스 두개골 안면 발달 동안 중요한 시점을 나타낸다. 또한, 상악 과정 및 구개골 선반에서 유래 된 세포는 후자의 구조가 전자의 유도체이기 때문에 여기에서 선택되었으며, 따라서 연구자들은 관련 맥락에서 생체 내 및 시험관 내에서 단백질 인산화를 조사 할 수있는 기회를 제공합니다. 그러나이 프로토콜은 대체 얼굴 프로세스 및 발달 시점에도 적용 할 수 있습니다.

인산화된 단백질을 연구할 때 중요한 문제는 풍부한 환경 포스파타제에 의한 단백질 분리 중에 쉽게 탈인산화된다는 것입니다. 이러한 장벽을 극복하기 위해 인산화 단백질의 분리를 허용하는 표준 실험실 방법에 대한 적응 및 변형이 논의됩니다. 또한, 인산화된 단백질의 적절한 분석 및 정량화를 위한 모범 사례가 제공됩니다. 이러한 기술은, 특히 약리학적 억제제 및/또는 뮤린 유전 모델과 조합하여, 두개골 안면 발달 동안 활성인 다양한 신호전달 경로의 역학 및 역할에 대한 더 큰 통찰력을 얻기 위해 사용될 수 있다.

Protocol

동물과 관련된 모든 절차는 콜로라도 대학 안슈츠 메디컬 캠퍼스의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 제도적 지침 및 규정을 준수하여 수행되었습니다. 암컷 129S4 마우스를 1.5-6개월령에 21-23°C의 열중성 이하 온도에서 사육하여 배아 수확에 사용하였다. 프로토콜의 개략적인 워크플로우는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료,…

Representative Results

마우스 안면 과정 및/또는 배양된 구개 중간엽 세포로부터 분리된 단백질의 인산화를 특성화하려고 시도할 때, 대표적인 결과는 상응하는 총 단백질 밴드의 높이 또는 그 근처에서 실행되는 항-포스포단백질 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 이어 뚜렷하고 재현 가능한 밴드를 이상적으로 드러낼 것이다(그림 3 ). 그러나, 단백질의 광범위한 인산화가 발생하는 경우, 전체 단?…

Discussion

여기에 설명 된 프로토콜을 통해 연구원은 두개골 안면 발달 중에 중요한 인산화 의존성 신호 전달 사건을 강력하고 재현 가능한 방식으로 조사 할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 적절한 데이터 수집 및 결과 분석을 보장하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 마우스 안면 과정 및/또는 배양된 구개골 중간엽 세포로부터 포스포단백질을 분리하든, 지시될 때 모든 시약과 물질을 얼음 위에 유지하?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

129S4 마우스는 시나이 산의 이칸 의과 대학 필립 소리아노 박사의 선물이었다. 이 연구는 NIH (National Institutes of Health) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 및 K02 DE028572에서 K.A.F., F31 DE029976에서 M.A.R. 및 F31 DE029364에서 B.J.C.D.까지의 기금으로 지원되었습니다.

Materials

Equipment
Block for mini dry bath Research Products International Corp 400783
ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software Bio-Rad 1708265 chemiluminescence imager
CO2 incubator, air jacket VWR 10810-902
Dissecting board, 11 x 13 in Fisher Scientific 09 002 12
Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module Bio-Rad 1658030
Hybridization oven Fisher Scientific UVP95003001
Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf) Sigma Aldrich Z604062
Mini dry bath Research Products International Corp 400780
Orbital shaker VWR 89032-092
pH meter VWR 89231-662
Power supply for SDS-PAGE Bio-Rad 1645050
Rectangular ice pan, maxi 9 L Fisher Scientific 07-210-093
Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light Zeiss 4350649020000000 dissecting microscope
Timer VWR 62344-641
Tube revolver Fisher Scientific 11 676 341
Vortex mixer Fisher Scientific 02 215 414
Water bath VWR 89501-472
Western blot box Fisher Scientific NC9358182
Materials
Cell culture dishes, 6 cm Fisher Scientific 12-565-95
Cell culture plates, 12 well Fisher Scientific 07-200-82
Cell lifters Fisher Scientific 08-100-240
CO2 Airgas CD USP50
Conical tubes, polypropylene, 50 mL Fisher Scientific 05-539-13
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20
Embryo spoon Fine Science Tools 10370-17
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL VWR 89000-010
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL VWR 20170-038
Pasteur pipet, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6A
Pasteur pipet, 9" VWR 14672-380
Petri dishes, 10 cm Fisher Scientific 08-757-100D
Petri dishes, 35 mm Fisher Scientific FB0875711YZ
Pouches, transparent, polyethylene lining Fisher Scientific 01-812-25B
PVDF membrane Fisher Scientific IPVH00010
Semken forceps Fine Science Tools 11008-13
Small latex bulb, 2 mL VWR 82024-554
Surgical scissors Fine Science Tools 14002-12
Syringe filter, 25 mm, 0.2 μm pore size Fisher Scientific 09-740-108
Syringe with luer tip, 10 mL VWR BD309604
Transfer pipet Fisher Scientific 13-711-22
Western blot cassette opening lever Bio-Rad 4560000
Whatmann 3MM chr chromatography paper Fisher Scientific 05-714-5
Reagents
4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 µL Bio-Rad 4561083
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G5422-25G stock concentration 1 M
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-100ML
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested Fisher Scientific BP1600-100
Bromophenol blue Fisher Scientific AC403140050
Complete mini protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 11836153001 stock concentration 25x
DC protein assay kit II Bio-Rad 500-0112
DMEM, high glucose Gibco 11965092
E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL Developmental Studies Hybridoma Bank E7 1:1,000
ECL western blotting substrate Fisher Scientific PI32106 low picogram range
ECL western blotting substrate Genesee Scientific 20-302B low femtogram range
Electrophoresis buffer, 5 L Bio-Rad 1610772 stock concentration 10x
Ethanol, 200 proof, 1 gallon Decon Laboratories, Inc. 2705HC EtOH
Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.) Fisher Scientific BP120-500 EDTA
Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL HyClone SH30071.03
Glycerol (certified ACS) Fisher Scientific G33-4
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 115-035-146 1:20,000
HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-003 1:20,000
Hydrochloric acid solution, 6N (certified) Fisher Scientific SA56-500 HCl
Igepal Ca – 630 non-ionic detergent Fisher Scientific ICN19859650 Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC) Fisher Scientific A451-1
L-glutamine Gibco 25030081 stock concentration 200 mM
Methanol Fisher Scientific A454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9102S 1:1,000; anti-Erk1/2
PDGF-BB recombinant ligand, rat Fisher Scientific 520BB050
PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3169S 1:1,000
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 stock concentration 100 U/mL, 100 µg/mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99% Fisher Scientific AC215740100 PMSF; stock concentration 100 mM
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody Cell Signaling Technology 9101S 1:1,000, anti-phospho-Erk1/2
Phospho-PDGF Receptor α /PDGF Receptor β primary antibody Cell Signaling Technology 3170S 1:1,000
Potassium chloride (white crystals) Fisher Scientific BP366-500 KCl
Potassium phosphate monobasic (white crystals) Fisher Scientific BP362-500 KH2PO4
SDS solution, 10% Bio-Rad 161-0416
Sodium chloride (crystalline/biological,certified) Fisher Scientific S671-3 NaCl
Sodium fluoride (powder/certified ACS) Fisher Scientific S299-100 NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M
Sodium orthovanadate, 99% Fisher Scientific AC205330500 Na3VO4; stock concentration 100 mM
Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS) Fisher Scientific S374-500 Na2HPO4
Tissue culture PBS Fisher Scientific 21-031-CV
Transfer buffer, 5 L Bio-Rad 1610771 stock concentration 10x
Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology) Fisher Scientific BP152-1
Trypsin BioWorld 21560033
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Western blot molecular weight marker Bio-Rad 1610374
Software
ImageJ software National Institutes of Health
Animals
Female 129S4 mice gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai
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References

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Rogers, M. A., Dennison, B. J. C., Fantauzzo, K. A. Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63834, doi:10.3791/63834 (2022).
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