从小鼠面部过程和培养的腭间充质细胞中分离全细胞蛋白质裂解物以进行磷酸化蛋白分析

哺乳动物颅面发育是一个复杂的形态学过程，在此期间，多个细胞群协调以产生额鼻骨骼。在小鼠中，该过程始于胚胎日（E）9.5，形成额鼻突出和成对的上颌骨和下颌过程，每个过程都包含迁移后颅神经嵴细胞。外侧和内侧鼻突起源于额鼻突出，伴有鼻坑的出现，最终融合形成鼻孔。此外，内侧鼻突和上颌突融合以产生上唇。同时，腭生成始于E11.5时从上颌过程的口腔侧形成不同的生长 – 次级腭架。随着时间的推移，腭架在舌头的两侧向下生长，上升到舌头上方的相反位置，并最终在中线融合形成连续的腭，将鼻腔和口腔分开E16.5¹。

这些在整个颅面发育过程中的形态变化是通过各种信号传导相互作用开始和维持的，其中通常包括激酶的蛋白质磷酸化。例如，细胞膜受体，例如转化生长因子（TGF）-β受体的亚家族，包括骨形态发生蛋白受体（BMPRs）和各种受体酪氨酸激酶（RTK）家族，在颅神经嵴细胞中的配体结合和激活时自磷酸化^2，3，4.此外，G蛋白偶联的跨膜受体平滑在颅神经嵴细胞和颅面外胚层中磷酸化，声波刺猬（SHH）配体与Patched1受体结合，导致睫状膜处平滑积聚和SHH途径激活⁵。这种配体-受体相互作用可以通过颅面环境中的自分泌、旁分泌和/或并列子碱信号传导发生。例如，已知BMP6在软骨细胞分化⁶期间以自分泌方式发出信号，而成纤维细胞生长因子（FGF）8在咽弓外胚层中表达，并与以旁分泌方式在咽弓间充质中表达的RTK家族的FGF家族成员结合，以启动咽弓的图案化和生长^{7，8，9，10}.此外，当跨膜Delta和/或锯齿状配体与邻近细胞上的跨膜Notch受体结合时，在颅面骨骼发育过程中，通过并列他克林信号传导在软骨细胞和成骨细胞中激活Notch信号传导，随后被切割和磷酸化¹¹。然而，还有其他配体和受体对对颅面发育很重要，它们具有在自身分泌和旁分泌信号传导中起作用的灵活性。例如，在鼠牙形态发生期间，血小板衍生生长因子（PDGF）-AA配体已被证明以自分泌方式发出信号以激活牙釉质器官上皮¹²中的RTK PDGFRα。相反，在妊娠中期的鼠面部过程中，编码配体PDGF-AA和PDGF-CC的转录本在颅面外胚层中表达，而PDGFRα受体在潜在的颅神经嵴衍生的间充质中表达，导致旁分泌信号传导^{13，14，15，16，17}.无论信号传导机制如何，这些受体磷酸化事件通常导致接合蛋白和/或信号分子的募集，这些分子经常自身被磷酸化以引发细胞内激酶级联反应，例如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径^18，19。

然后，这些级联的末端细胞内效应子可以磷酸化一系列底物，例如转录因子，RNA结合，细胞骨架和细胞外基质蛋白。Runx2²⁰，Hand1²¹，Dlx3 / 5^22，23，24，Gli1-3²⁵和Sox9²⁶ 是颅面发育中磷酸化的转录因子之一。这种翻译后修饰（PTM）可以直接影响对替代PTM的敏感性，二聚化，稳定性，裂解和/或DNA结合亲和力，以及其他活性^{20，21，25，26}。此外，RNA结合蛋白Srsf3在颅面发育的背景下被磷酸化，导致其核易位²⁷。一般而言，RNA结合蛋白的磷酸化已被证明会影响其亚细胞定位，蛋白质 – 蛋白质相互作用，RNA结合和/或序列特异性²⁸。此外，肌动肌肽的磷酸化可导致整个颅面发育过程中的细胞骨架重排^29，30，并且细胞外基质蛋白的磷酸化，例如小的整合素结合配体N-连接的糖蛋白，有助于骨骼发育过程中的生物矿化³¹。通过上述和许多其他例子，很明显，在颅面发育过程中，蛋白质磷酸化具有广泛的意义。添加额外的调节水平，蛋白质磷酸化通过磷酸酶进一步调节，其通过去除磷酸基团来抵消激酶。

受体和效应分子水平上的这些磷酸化事件对于信号通路的传播至关重要，并最终导致细胞核中基因表达的变化，驱动特定的细胞活动，如迁移，增殖，存活和分化，从而导致哺乳动物面部的适当形成。鉴于蛋白质与激酶和磷酸酶相互作用的背景特异性，PTMs的变化及其对细胞活性的影响，在生理相关环境中研究这些参数以完全了解磷酸化事件对颅面发育的贡献至关重要。这里提供了研究蛋白质磷酸化并因此在哺乳动物颅面发育过程中信号通路激活的两种情况的示例：小鼠面部过程，特别是E11.5上颌过程，以及来自E13.5次级腭架的培养小鼠胚胎腭间充质细胞 – 主要³² 和永生^化33.在E11.5中，上颌突处于与外侧和内侧鼻突¹融合的过程中，从而代表了小鼠颅面发育过程中的关键时间点。此外，这里选择了上颌骨过程和来自腭架的细胞，因为后者的结构是前者的衍生物，从而为研究人员提供了在相关背景下 在体内 和 体外 询问蛋白质磷酸化的机会。然而，该协议也适用于替代面部过程和发育时间点。

研究磷酸化蛋白质的一个关键问题是，在蛋白质分离过程中，它们很容易被丰富的环境磷酸酶去磷酸化。为了克服这一障碍，讨论了允许分离磷酸化蛋白质的标准实验室方法的适应性和修改。此外，还提供了对磷酸化蛋白质进行正确分析和定量的最佳实践。这些技术，特别是与药理学抑制剂和/或小鼠遗传模型结合使用，可用于更深入地了解颅面发育过程中活跃的各种信号通路的动力学和作用。