تحليل التدفق الخلوي للمؤشرات الحيوية للكشف عن العيوب الوظيفية للحيوانات المنوية البشرية
Summary
يوفر البروتوكول الحالي حلا عمليا يسمح بقياس موت الخلايا المبرمج ، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا ، وتلف الحمض النووي في الحيوانات المنوية البشرية باستخدام مقياس خلوي واحد.
Abstract
يستخدم تحليل معلمة السائل المنوي التقليدي على نطاق واسع لتقييم خصوبة الذكور. ومع ذلك ، فقد وجدت الدراسات أن ~ 15 ٪ من مرضى العقم لا يظهرون أي تشوهات في معايير السائل المنوي التقليدية. هناك حاجة إلى تقنيات إضافية لشرح العقم مجهول السبب والكشف عن عيوب الحيوانات المنوية الدقيقة. في الوقت الحالي ، تكشف المؤشرات الحيوية لوظيفة الحيوانات المنوية ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية ، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP) ، وتلف الحمض النووي ، عن فسيولوجيا الحيوانات المنوية على المستوى الجزيئي وهي قادرة على التنبؤ بخصوبة الذكور.
باستخدام تقنيات قياس التدفق الخلوي (FCM) ، يمكن قياس كل من هذه العلامات بسرعة ودقة ودقة في عينات السائل المنوي البشري ، ولكن تكاليف الوقت تزداد بشكل كبير ويمكن إعاقة النتائج إذا احتاجت جميع المؤشرات الحيوية إلى الاختبار باستخدام مقياس خلوي واحد. في هذا البروتوكول ، بعد الجمع والحضانة الفورية عند 37 درجة مئوية للتسييل ، تم تحليل عينات السائل المنوي بشكل أكبر بحثا عن موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية باستخدام تلطيخ Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) / بروبيديوم يوديد (PI). تم تمييز MMP بمسبار 5،5 ′ ، 6،6 ′-رباعي كلورو -1،1 ′ ، 3،3 ′-رباعي إيثيل – بنزيميدازول كاربوسيانين يوديد (JC-1) ، وتم تقييم تلف الحمض النووي باستخدام مقايسة بنية كروماتين الحيوانات المنوية (SCSA) مع تلطيخ برتقال أكريدين (AO). وبالتالي ، يمكن أن يكون تحليل التدفق الخلوي لعلامات وظيفة الحيوانات المنوية مجموعة أدوات عملية وموثوقة لتشخيص العقم وتقييم وظيفة الحيوانات المنوية في كل من المقعد والسرير.
Introduction
أصبح العقم مشكلة صحية عامة ، حيث يساهم العقم عند الذكور بنسبة 40٪ -50٪ من جميع الحالات 1,2. على الرغم من أن تحليل جودة السائل المنوي التقليدي يلعب دورا مهما في تحديد إمكانات خصوبة الذكور ، إلا أن ما يقرب من 15٪ من مرضى العقم لديهم معايير طبيعية للحيوانات المنوية مثل عدد الحيوانات المنوية وحركتها ومورفولوجيا3. علاوة على ذلك ، فإن فحوصات الحيوانات المنوية الروتينية لها قابلية تكرار ضعيفة ، وتوفر معلومات محدودة عن وظيفة الحيوانات المنوية ، ولا يمكنها إعطاء تقييم دقيق لخصوبة الذكور أو تعكس العيوب الدقيقة للحيوانات المنوية. تم تطوير تقنيات متعددة لاختبار وظيفة الحيوانات المنوية ، مثل فحص hemizona (HZA) ، ومقايسة اختراق الحيوانات المنوية ، واختبار التورم تحت التناضح ، واختبار الأجسام المضادة للحيوانات المنوية ، ولكن هذه الطرق تستغرق وقتا طويلا وعرضة للتأثيرات الذاتية للمشغلين. لذلك ، من الضروري تطوير طرق سريعة ودقيقة لتحليل وظائف الحيوانات المنوية.
FCM هي تقنية تحليل سريعة أحادية الخلية تم تطويرها في سبعينيات القرن العشرين ، والتي تم استخدامها على نطاق واسع في مختلف مجالات بيولوجيا الخلية والطب. FCM هي أداة قوية لتقييم وظيفة الحيوانات المنوية التي تحلل الحيوانات المنوية المسمى بمسبار مضان محدد4. تمر الحيوانات المنوية عبر أشعة الليزر أحادية القناة أو متعددة القنوات ، ويتم إنتاج الضوء المتناثر والتألق المنبعث بواسطة شعاع ليزر. يتضمن الضوء المبعثر الضوء المبعثر الأمامي (FSC) والضوء المبعثر الجانبي (SSC) ، والذي يعكس حجم الخلية المختبرة ودقة الخلية أو البنية الداخلية. يتم جمع هذه الإشارات وعرضها وتحليلها بواسطة نظام الكمبيوتر ، وبالتالي ، يتم قياس سلسلة من الخصائص من الحيوانات المنوية بسرعة وبدقة. لذلك ، فإن FCM هي تقنية سريعة وموضوعية ومتعددة الأبعاد وعالية الإنتاجية اكتسبت اهتماما متزايدا في مجال تحليل الحيوانات المنوية. يمكن لتطبيق FCM تعويض أوجه القصور في الطرق التقليدية ويوفر نهجا جديدا للكشف عن البنية الداخلية للحيوانات المنوية ووظيفتها.
يرتبط موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية ارتباطا وثيقا بخصوبة الذكور5. يعد الكشف عن موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية مؤشرا مهما لتقييم وظيفة الحيوانات المنوية على المستوى الجزيئي. يعرف FCM على نطاق واسع بأنه طريقة موثوقة وحساسة للكشف عن موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية باستخدام تلطيخ Annexin V-FITC / PI. المبدأ الأساسي هو أن فوسفاتيديل سيرين (PS) ينتقل من الطبقة الداخلية لغشاء الخلية إلى طبقته الخارجية في المرحلة المبكرة من موت الخلايا المبرمج. Annexin V هو بروتين فوسفوليبيد يعتمد على الكالسيوم2+ (عادة ما يتم تصنيفه بواسطة FITC) وله تقارب كبير مع PS ، وبالتالي ، يكتشف PS المكشوف للسطح الخارجي لغشاء الخلية6. يمكن تمييز النخر وموت الخلايا المبرمج مع تلطيخ Pl. لذلك ، يتم استخدام طريقة التلوين المزدوج Annexin V-FITC / PI على نطاق واسع ، لأنها سريعة وبسيطة وسهلة للكشف عن خلايا الحيوانات المنوية المختلفة لموت الخلايا المبرمج.
يحتوي الحيوان المنوي الناضج للثدييات على ما يقرب من 72-80 ميتوكوندريا7 ، مما يشير إلى سبب بيولوجي للاحتفاظ بالحيوانات المنوية الميتوكوندريا8. تم العثور على الميتوكوندريا المنوية للعب أدوار مهمة في الحفاظ على حركة الحيوانات المنوية والخصوبة9. تعد صبغة JC-1 ، التي يمكن استخدامها كمؤشر ل MMP في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، واحدة من أكثر الفلوروكرومات شيوعا لتقييم نشاط الميتوكوندريا للحيوانات المنوية10. JC-1 هي صبغة كاتيونية تتراكم بشكل محتمل في الميتوكوندريا. يحتوي JC-1 على أقصى انبعاث مضان عند 525 نانومتر (أخضر) ويشكل مجاميع J 11 عند الارتباط بالأغشية ذات الإمكانات العالية (ΔΨm ، 80-100 mV) ، مما يؤدي إلى تحول في انبعاث التألق إلى ~ 590 نانومتر (برتقالي-أحمر). وبالتالي ، يشار إلى إزالة استقطاب الميتوكوندريا المنوية من خلال انخفاض في نسبة شدة التألق الأحمر / الأخضر ، ويمكن استخدام FCM للكشف عن مستويات MMP في عينات السائل المنوي البشري.
تم اختراع منهجية SCSA بواسطة Evenson et al.12 ، ويعتبر اختبارا دقيقا وقابلا للتكرار مع بيانات فريدة ثنائية المعلمات (مضان أحمر مقابل أخضر) على مقياس 1024 × 1024 قناة 13. في الحيوانات المنوية التالفة ، يتم تمييز الحمض النووي والبروتينات المتغيرة في نوى الحيوانات المنوية بواسطة AO ، ويتم قياس كسور شريط الحمض النووي بواسطة مضان أحمر ، بينما تنبعث الخيوط المزدوجة السليمة من مضان أخضر في FCM14. في الوقت الحاضر ، تم تطوير العديد من الطرق لتقدير سلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية. ومع ذلك ، على عكس SCSA ، غالبا ما تكون هذه المقايسات كثيفة العمالة وتفتقر إلى القدرة على تشخيص العقم عند الذكور. ترتبط نتائج اختبار SCSA بشكل كبير بحمل الحمض النووي البشري والإجهاض ، وتوفر أدلة دامغة على أن SCSA قد يكون مفيدا في تحليل السائل المنوي البشري ، وقد يكون بمثابة أداة قيمة لأطباء العقم15.
تعكس سلامة الكروماتين و MMP وموت الخلايا المبرمج جوانب مختلفة من وظيفة الحيوانات المنوية ، وبالتالي ، فإن الجمع بين هذه المؤشرات الحيوية قد يوفر نظرة ثاقبة أكثر شمولا لحالة الحيوانات المنوية. يمكن استخدام FCM لإجراء قياسات منفصلة إما لسلامة الكروماتين أو MMP أو موت الخلايا المبرمج في عينات السائل المنوي البشري. على الرغم من أن تكلفة FCM وتكلفة الأصباغ قد حدت من التطبيق الواسع لهذه التقنيات في المختبرات السريرية للصحة الإنجابية ، إلا أن قيمتها لتقدير الخصوبة مقبولة.
ومع ذلك ، نظرا لأن كل تجربة تتطلب معالجة مسبقة لعينات الحيوانات المنوية ، ويجب اختبار جميع العينات المعالجة مسبقا في أقرب وقت ممكن ، فإن القياس المتزامن لجميع المؤشرات الحيوية الثلاثة لعينة باستخدام FCM واحد قد يؤدي إلى وقت انتظار طويل لبعض التجارب ويعيق موثوقية النتائج. وذلك لأن الحيوانات المنوية تتلقى أضرارا إضافية أثناء عملية الانتظار ، إذا لم يتم ترتيب البروتوكول بشكل صحيح مع مراعاة جميع التجارب الثلاث بالكامل. تقدم هذه الورقة بروتوكولا يحقق القياس الطلاقة لجميع المؤشرات الحيوية الثلاثة في قياس خلوي واحد دون المساس بشكل كبير بجودة التجربة الناجمة عن أوقات الانتظار الطويلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم العثور على سلامة الكروماتين ، MMP ، وموت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية البشرية لتكون منبئات قيمة للنتائج الإنجابية. كما سلط أحدث دليل مختبري صادر عن منظمة الصحة العالمية لفحص ومعالجة السائل المنوي البشري (الطبعة السادسة) الضوء على بعض هذه المؤشرات (سلامة الكروماتين وموت الخلايا المبرمج) كفحوصات موسعة تتجاوز الفحص الأساسي للبارامترات الروتينية مثل عدد الحيوانات المنوية18. وتشير المنشورات الأخيرة أيضا إلى أن هذه المؤشرات قد تكون علامات أكثر حساسية للاستجابة للتعرضات الخطرة الخارجية، مما يشير إلى قدرتها على تحديد الضرر التناسلي في مرحلة مبكرة19،20. قد يوفر الجمع بين هذه المؤشرات والفحوصات الروتينية أيضا فهما أكثر شمولا حول ملف ضعف الحيوانات المنوية وتعقيد الضرر التناسلي للذكور لدى السكان.
هناك العديد من القضايا الرئيسية التي تحدد بشكل كبير نجاح تحليل الحيوانات المنوية مع FCM. أولا ، يتطلب قياس الحيوانات المنوية MMP وموت الخلايا المبرمج فحصا فوريا بعد تسييل السائل المنوي. لتقليل تكلفة الوقت ، يمكن لفنيين أن يتوليا بشكل منفصل مسؤولية المعالجة المسبقة ل MMP وتحليل موت الخلايا المبرمج للعينة. نظرا لأن المعالجة المسبقة لموت الخلايا المبرمج أبسط ، فإنها ستنتقل إلى خطوة قياس التدفق الخلوي بشكل أسرع من تحليل MMP. بالنسبة لتحليل SCSA ، يجب حفظ عينات السائل المنوي الطازجة بالتبريد فور توفرها بعد التسييل. يمكن بعد ذلك تخزين عينات الحيوانات المنوية في النيتروجين السائل لفترة طويلة نسبيا ولا تحتاج إلى فحص فوري.
وفقا لذلك ، يمكن ضغط التكلفة الزمنية للتجربة في الموقع إلى 40 دقيقة ، وهي مدة تحليل MMP بالإضافة إلى خطوة التدفق الخلوي لتحليل الحيوانات المنوية. ثانيا ، يجب تحديد إعداد البوابة في منصة القياس الخلوي للتدفق لكل دفعة من العينات بشكل منفصل. يمكن اختيار عينات الحيوانات المنوية ذات المجموعات الفرعية للخلايا الصافية في مخطط التشتت كمرجع لرسم منطقة البوابة. ثالثا ، نظرا لعدم وجود قيم مرجعية سريرية مقبولة على نطاق واسع لمؤشرات هذه التجربة ، يمكن استخدام النتائج التاريخية كأداة مهمة لمراقبة الجودة. كما يتم تشجيع ضبط الضوابط الإيجابية والسلبية في كل دفعة من القياسات ، خاصة بالنسبة ل SCSA و MMP.
النتائج التمثيلية لتحليل الحيوانات المنوية المقدمة هنا مشتقة باستخدام Accuri C6. ومع ذلك ، يمكن تطبيق هذه التقنية على منصات تجارية أخرى مع تعديل طفيف. عادة ، ستكون هناك حاجة إلى ما مجموعه 5 × 106 خلايا منوية لتلبية متطلبات قياس جميع المؤشرات. إذا كان تركيز الحيوانات المنوية للعينة أقل بكثير من المستوى المتوسط ، فستزداد الحاجة إلى حجم السائل المنوي.
على غرار المعلمات الروتينية للحيوانات المنوية ، هناك أيضا اختلاف ملحوظ داخل الفرد في سلامة الكروماتين ، MMP ، وموت الخلايا المبرمج للحيوانات المنويةالبشرية 21. وفقا لذلك ، قد توفر الاختبارات المتعددة للعينات التي تم جمعها في أوقات مختلفة تقديرا أكثر دقة لمستوى تلف وظيفة الحيوانات المنوية. على الرغم من عدم وجود فترة موصى بها للامتناع عن ممارسة الجنس قبل أخذ عينات من الحيوانات المنوية لتحليل التدفق الخلوي ، يمكن اعتماد 2-7 أيام من الامتناع عن القذف ، التي اقترحتها منظمة الصحة العالمية للتحليل الروتيني للحيوانات المنوية. وقد يساعد ذلك على تحسين إمكانية مقارنة النتائج بين المختبرات وبين العينات المختلفة التي جمعت من نفس الرجال.
أحد القيود الرئيسية لهذه الطريقة هو أن اثنين من المؤشرات الحيوية الثلاثة التي تم اختبارها – موت الخلايا المبرمج وإمكانية غشاء الميتوكوندريا – تتطلب عينات جديدة من السائل المنوي. هذا قد يحد من تطبيقها على الرجال الذين يمكنهم تقديم عينات السائل المنوي إلى المختبر. لاختبار تلف الحمض النووي (SCSA) ، يجب تحضير عينات مرجعية قبل التجربة لمعايرة مقياس التدفق الخلوي. وتجدر الإشارة إلى أن تطبيق البروتوكول الحالي يتطلب أداة FCM في المختبر ، والتي لا تزال تمثل تحديا كبيرا للعديد من المختبرات السريرية ، على الرغم من أن التعاون مع خدمة طرف ثالث قد يكون خيارا بديلا في بعض المناطق.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن حساب الأصباغ والكواشف الأخرى هو أيضا عامل مالي للذكور الذين قد يحتاجون إلى الفحص. أخيرا ، قد يحتاج البروتوكول إلى تعديل إذا تم استخدام علامات تجارية أو إصدارات مختلفة من FCM لفحص المؤشرات الحيوية. باختصار ، تقدم هذه الورقة نهجا عمليا لتقدير ثلاثة مؤشرات حيوية لتلف الحيوانات المنوية البشرية بواسطة آلة قياس خلوي أحادية التدفق. قد يوفر هذا معلومات قيمة حول الصحة الإنجابية للذكور ويكمل الفحص الروتيني للحيوانات المنوية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جميع العاملين الميدانيين على مساعدتهم والأشخاص الذين تمت مقابلتهم على تعاونهم.
Materials
| 0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
| 10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
| 1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
| 37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
| 5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
| Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
| Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
| Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
| AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
| Biological safety hood | Airtech, USA | ||
| Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
| Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
| Equipments | |||
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
| FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
| Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
| liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
| Materials | |||
| PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
| Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
| The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
| TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
| TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 1-9 (2015).
- Nachtigall, R. D. International disparities in access to infertility services. Fertility and Sterility. 85 (4), 871-875 (2006).
- Agarwal, A., Allamaneni, S. S. R. Sperm DNA damage assessment: a test whose time has come. Fertility and Sterility. 84 (4), 850-853 (2005).
- Peña, F. J., Ortega Ferrusola, C., Martín Muñoz, P. New flow cytometry approaches in equine andrology. Theriogenology. 86 (1), 366-372 (2016).
- Oosterhuis, G. J., et al. Measuring apoptosis in human spermatozoa: a biological assay for semen quality. Fertility and Sterility. 74 (2), 245-250 (2000).
- Koopman, G., et al. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84 (5), 1415-1420 (1994).
- Freitas, M. J., Vijayaraghavan, S., Fardilha, M. Signaling mechanisms in mammalian sperm motility. Biology of Reproduction. 96 (1), 2-12 (2017).
- Lehti, M. S., Sironen, A. Formation and function of sperm tail structures in association with sperm motility defects. Biology of Reproduction. 97 (4), 522-536 (2017).
- Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), 13666 (2021).
- Agnihotri, S. K., et al. Mitochondrial membrane potential (MMP) regulates sperm motility. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 52 (9), 953-960 (2016).
- Smiley, S. T., et al. Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (9), 3671-3675 (1991).
- Evenson, D. P., Darzynkiewicz, Z., Melamed, M. R. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science. 210 (4474), 1131-1133 (1980).
- Evenson, D. P., Djira, G., Kasperson, K., Christianson, J. Relationships between the age of 25,445 men attending infertility clinics and sperm chromatin structure assay (SCSA®) defined sperm DNA and chromatin integrity. Fertility and Sterility. 114 (2), 311-320 (2020).
- Evenson, D. P. Sperm chromatin structure assay (SCSA®). Methods in Molecular Biology. 927, 147-164 (2013).
- Agarwal, A., Said, T. M. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Human Reproduction Update. 9 (4), 331-345 (2003).
- Ricci, G. Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes. Human Reproduction. 17 (10), 2665-2672 (2002).
- Zhang, H. -. B., et al. Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation. Asian Journal of Andrology. 10 (2), 227-235 (2008).
- . WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2022)
- Evenson, D. P., Wixon, R. Environmental toxicants cause sperm DNA fragmentation as detected by the Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). Toxicology and Applied Pharmacology. 207 (2), 532-537 (2005).
- Wang, Y. X., et al. Phthalate exposure in association with serum hormone levels, sperm DNA damage and spermatozoa apoptosis: A cross-sectional study in China. Environmental Research. 150, 557-565 (2016).
- Ni, W., et al. Diurnal variation in sperm DNA fragmentation: analysis of 11,382 semen samples from two populations and in vivo animal experiments. Chronobiology International. 36 (11), 1455-1463 (2019).
