げっ歯類組織のショットガンリピドミクス

MSの進歩により、多くの脂質種を正確にモニタリングするためのさまざまな方法が生まれましたが、さまざまな哺乳類組織の以前の脂質プロファイリングでは一貫した結果が得られず、その結果、脂質の特定の組織特異的機能は不明のままです。特定の化合物の発現をノックアウトするためのより堅牢なアプローチが利用可能なタンパク質機能解析と比較して、大部分の脂質を選択的にオフにしたり、組織内で過剰発現させたりすることができないため、脂質の機能評価が困難になります。組織リピドーム濃度の高度なプロファイリングは、循環脂質とヒト疾患との関連を特定するための代替アプローチを提供する可能性があります。

あらゆるマウス組織の内因性脂質プロファイルを定性的および定量的にカバーできる包括的なリピドミクス法を評価する際には、ショットガンリピドミクス法を優先しました。一般に、サンプル分析には、液体クロマトグラフィー(LC)ベースの分離を使用した脂質の完全ノンターゲットスクリーニングと、サンプルの総脂質の複雑さを明らかにするためのさらなる質量分析検出、または目的の特定の脂質の非常に正確な定量を可能にするターゲットアプローチの2つの反対のタイプが可能です。対照的に、提示されたショットガンリピドミクスワークフローの強力な特徴は、事前定義された脂質クラスからの数百の内因性脂質の迅速で包括的なカバレッジであり、これは依然として堅牢な半定量的な方法で実行できます。

異なる脂質クラスのイオン化効率は構造に依存し、異なる実験イオン化条件に応じて大きく変化する可能性があります。LCベースの分離方法とは対照的に、ショットガン分析は、同じイオン化条件下で脂質抽出物全体をMS装置に直接同時に注入するため、これらの違いを最小限に抑えます。同位体標識脂質類似体または構造的に類似した非内因性標準物質の使用は、すべての脂質クラスの半定量を可能にする。ショットガンリピドミクスは、MS分析中のラン間およびラン内の変動性が低いです。その結果、この方法は、適切な定量のために複数の標準を必要とする非標的液体クロマトグラフィーベースの方法よりも低い変動係数²¹ を生成します。重要なことに、現在の方法では外部検量線が使用されていませんが、この方法は依然として完全に定量的であると考えられています³²。

脂質クラス当たり1レベルの標識内部標準物質(または内因的に発現していない非標識標準物質)は、ほとんどの脂質の定量に十分である。ショットガンリピドミクス法の部分的な方法検証を報告している出版物はごくわずかです。例えば、Gryzbek et ^al.17およびSurmaら²¹では、内部標準物質および一定量のサンプルマトリックスを用いて逆検量線を調製した。直線性は、対数変換された脂質量およびそれらの強度の線形回帰によって評価され、それぞれR2および傾きとして報告された。検出限界(LOD)と定量限界(LOQ)は、LODの信号対雑音比3とLOQの10に基づく重み付き線形回帰によって決定されました。ほとんどの脂質クラスについて、LOQは脂肪組織では2〜9.8 pmol、血漿では0.05〜5μMの間で定義されていました。どちらの場合も、クラスごとの非内因性の単一の内部標準を使用して、クラス内のすべての脂質の推定値を導き出しました。ただし、この研究では、内因性マトリックスが化合物フリーではなく、組織の代理マトリックスが利用できないといういくつかの懸念からLOD/LOQを提供していません。純粋な標準物質が存在せず、同位体標識脂質の入手可能性が非常に限られているため、同一の同位体標識標準物質で正規化された特定の化合物の検量線シリーズを使用する古典的な標的定量アプローチは実行しません。Orbitrap検出器は、フーリエ変換を適用して過渡信号の変換を自動的に実行し、一部の信号はすでに置換されているため、低濃度範囲は最小信号まで直線的になり、それ以下では分子は検出できなくなります。Xcaliburソフトウェアの信号対雑音比は、分子のm/z比に依存します。その結果、脂肪酸の異なる組み合わせを含む各脂質クラスの化合物は、異なるノイズ値を有することになる。さらに、LOQ/LOQ値はマトリックスの種類と厳密に関連しており、異なるげっ歯類組織でリピドームの定量を行う場合は、各組織タイプのLOQを個別に評価することによって反映する必要があります。

実際、この方法は、最大4桁³³の高い線形動的定量範囲と、最も重要な内因性構造脂質をカバーする非常に優れた感度を提供し、MS取得³²の技術的改善によってさらに高めることができます。平均脂質濃度の変動係数はほとんどが15%未満であり、ショットガンリピドミクスは、グッドラボラトリープラクティス(GLP)およびグッドクリニカルプラクティス(GCLP)研究で考慮すべき方法として食品医薬品局(FDA)の要件に準拠していることを意味します³⁴。

ただし、極性が異なるため、一部の脂質クラスは特定のコンジュゲートFAの寄与によってはるかに影響を受けることに注意する必要があります。これは、広範囲の共役FAを含む等モル混合物における強度応答の歪みをもたらし、リン脂質クラスについてKoivusaloら³⁵ によって強調されているように、定量化バイアスをもたらす。注目すべきことに、これらの著者は、実際の生物学的サンプルの状況を反映していない可能性が高い、24〜48の鎖長からの幅広いFAのデータを提示しました。多価不飽和種に対する応答は、完全に飽和した種に対する応答よりも40%高かったが、この効果は高濃度でのみ観察された。混合物を徐々に希釈すると、不飽和の影響は徐々に減少し、種あたり0.1 pmol/μLで事実上消失しました。.さらに、すべての測定はイオントラップおよびトリプル四重極装置で行われ、Q-Exactive機器では行われませんでした。

提示されたワークフローのもう一つの利点は、特定のプロジェクト要件に適応できる技術的な柔軟性です。例えば、任意の脂質抽出プロトコル(修飾Bligh and Dyer³⁶、メチルtert-ブチルエーテル37、またはブタノール-メタノール³⁸メソッドなど)を使用して、MS分析前に総脂質抽出物を調製できます。クロロホルム – メタノール抽出の主な制限は、下相が脂質画分を含むことであり、これは日常業務、特に自動化を複雑にする。さらに、クロロホルムの毒性を考慮する必要があります。tert-ブチルエーテル抽出は、血漿サンプルの脂質分析に広く使用されており³⁷、自動化バージョンが提案されています²¹。この場合、BUME法を選択した理由は、スパイクPG、PI、PA、およびPS脂質クラス³⁸の回収率がさらに向上し、溶媒消費量が少なく、自動化の可能性が³⁹であり、3つの方法すべてで抽出された組織サンプルの定量化された全体的な濃度が同等であったためです。さらに、サンプル抽出は現在の作業では手動で行われていましたが、96ウェルフォーマットでの自動サンプル調製および脂質抽出によって、大規模なサンプルセットから再現性のある正確な結果を得ることもできます^40,41。これにより、大規模な臨床および毒物学的研究においてリピドミクス解析を実施することができます。

現在の研究では、Schuhmannら⁴²で説明されているように、極性を切り替えることなく、正モードと負モードのMS取得を別々に実行しました。ナノメイトシグナルの安定性は、ポジティブモードよりもわずかに濃度の低い溶液のネガティブモードで優れています。さらに、.rawファイルからmzMLへのコンバータソフトウェアを使用して完全に追跡可能な手順を開発し、LipidXplorerソフトウェアで指定する値を提供します-これにより、手動の分解能勾配計算は必要ありません。また、ポジティブモードではスペクトルのノイズレベルがネガティブモードよりも高いため、さまざまなノイズ設定の置換を適用しました。すべてのステップは、トレーサブルでハイスループットのルーチン分析用に最適化されています。

同定のために、ショットガンリピドミクス分析は、異なる極性モードで固有の付加体を形成する異なる脂質クラスの固有の挙動を利用することができる。この方法では、正イオン化モードで重複する同じ分子量のPC種とPE種を負イオン化モードで完全に分離することができ、PCは酢酸塩またはギ酸付加物を形成し、PEは脱プロトン化形態でイオン化されます。また、分子式だけでなくバルク脂肪酸構造も利用した方法では(部分的な)構造デコンボリューションが可能です。たとえば、総炭素および総不飽和数のレベルでのFA同定は、すべてのリン脂質、DAG、TAG、およびリゾリン脂質に対して機能します。各異性体形態のボトムアップ定量は、リン脂質クラス⁴³ の一部では部分的に実行できますが、MS2スペクトル内の異なるFAのシグナル応答が等しくないため、DAGおよびTAGでははるかに複雑です。

この分野における最近のイニシアチブと完全に一致した適切な品質管理手順を実施する必要性を強調することも重要です⁴⁴。ラボ間およびラボ内での適切なデータのトレーサビリティと再現性を確保したいため、分析のすべてのステップでサンプルを適切にランダム化すること、サプライヤー認定の標準混合物を使用した作業、品質管理サンプルを含めること、バッチの合格または拒否を検証する手順、QCパフォーマンスを長期的に追跡するための内部データベースの作成など、多くのステップが講じられています。また、これらのイニシアチブと一致しているのは、サンプルの安定性に対処するための標準化された方法の必要性です。一般に、構造脂質の大部分は脂質酸化の影響を受けないため、オキシリピン、酸化脂質、および多価不飽和脂肪酸に関連しているため、保管および取り扱い条件にはるかに敏感です。ただし、サンプルの安定性を正しく評価することは、依然として技術的に困難な作業です。

ただし、このプロトコルには、化合物の分子内レベルの決定に関しては制限があります。全抽出物の分離がないことを考慮して、同じ分子量で異なる脂肪酸組成を有する脂質のすべてのアイソフォームがMS分析にマージされます。ほとんどのクラスでは、MS2の残留脂肪酸フラグメントのフラグメンテーション比を使用して、構造の部分的なデコンボリューションを達成することが可能です。ただし、各アイソフォームの独立した定量は、異なるアイソフォームのフラグメンテーション挙動に大きな違いがあり、純粋な化学標準が補償値を定義するのに十分な種類で利用できないという事実のために、依然として特に困難な作業です。別の制限は、ESIプロセスが必然的にアーティファクトを生成し、その結果、DAG、Pas、FAなどの一部の脂質のピークが人工的に生成され、誤った定量につながる可能性があることです。

次に、私たちの経験に基づいてプロトコルの最も重要な部分を要約します。第1のものは、各マウス組織タイプが脂質量およびクラス比の両方に関して固有の脂質プロファイルを有するという事実に関連する。これにより、MSシグナルを飽和させず、高濃度での脂質凝集による動的定量範囲を離れないように、抽出前の総タンパク質含有量に基づく組織の開始量を慎重に決定する必要があります³³ 、または-反対の極端-各脂質クラスの主要な脂質化合物をカバーするのに十分なMSシグナルを提供します。

第2の重要な側面は、直接注入ナノソースチップ出口の位置と質量分析計の転写キャピラリーとの適切な位置合わせを確実にすることである。両方のモードでの質量分析計の完全なキャリブレーションが毎週実行されることを考えると、キャリブレーションソースとナノソースチップのセットアップの交換は、設置中のミスアライメントによる信号強度の劇的な変動の原因となる可能性があります。

プロトコルのもう一つの重要な部分は、内部標準ミックスの慎重な取り扱いです。この混合物には大量のジクロロメタンが含まれているため、開封すると、長期間の保管や蒸発や人為的な濃度変化につながる複数の使用を避けるために、迅速に消費する必要があります。さらに、温度差がエアクッションピペットでのピペッティング中に容量の不一致につながる可能性があるため、-20°Cの保管から取り出した後の標準混合物の一貫した取り扱いが重要です。標準的な再懸濁バッファー中のジクロロメタンを純粋なメタノールに置き換えることで、取り扱いの利便性が向上する可能性がありますが、一部の脂質クラスの溶解度に悪影響を及ぼし、これらの脂質クラスの定量精度が低下する可能性があります。

最後の重要な部分はデータ処理です。データ処理ワークフローは、.rawから.mzML形式へのPeak by Peakソフトウェア変換、MS2スキャン平均化、MS1およびMS2ノイズフィルタリングの適用、およびピークピッキングとデータ圧縮を組み合わせています。別の方法として、Proteowizardソフトウェアをデータ変換にも使用できますが、この場合、LipidXplorerのいくつかの設定を手動で定義する必要があります。ショットガンリピドミクスの全ての複雑さは、特に直接注入MS1およびMS2スペクトルのデコンボリューションのステップに集中している。オープンソースのLipidXplorerソフトウェアは、質量精度、質量分解能、およびm / zの増加に伴うその変化の傾きに基づいて、mzMLファイル形式から変換されたスペクトルをインポートします。このソフトウェアは、分析実行で取得した複数の個別のMSおよびMS/MSスペクトルをマージします。その後、異なるサンプルラン内で個々のピークを整列させ、整列したピークの各クラスターで、それらの質量を単一の強度加重平均質量に置き換えますが、各データファイル内の存在量は変更されません。整列したピーククラスターの代表的な質量と個々のピーク強度は、マスタースキャンデータベースに保存されます。マスタースキャンデータベースには、バッチ内のすべてのサンプルに対して生成されたすべてのMS1およびMS2スペクトルが含まれており、分子フラグメンテーションクエリ言語(MFQL)で記述されたクエリによって脂質識別にデコンボリューションできます。

全体として、この方法は、ポジティブモードに基づくDAG、TAG、およびSE脂質の同定、およびネガティブモード取得に基づくPC、PE、PS、PI、PA、PG、SM、LPC、およびLPE脂質の同定をカバーしています。脂質同定中、MS1およびMS2に対して同位体補正が行われ、調整された強度が.xlsx出力ファイルに報告されます。あるいは、ALEX⁴⁵ やLipidHunter⁴⁶など、ショットガンデータを処理するために他のいくつかのソフトウェアが利用可能です。

脂肪酸 – 主要な核および細胞膜成分 – は、生理活性分子へのさらなる変換のためにリン脂質の形で貯蔵される。それらは、リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ酵素によって、Lands経路⁴⁷を介してリゾリン脂質に変換され得る。LPCAT3酵素は、例えば、AAをリゾホスファチジルコリンやリゾホスファチジルセリン中間体に取り込む高い特異性を示すことが知られている。これらの酵素の比較的高い発現は、肺胞マクロファージや気管支上皮細胞などの炎症細胞内で報告されており⁴⁷、これらの細胞ではAA含有リン脂質の相対的な割合が大きく放出されています。しかしながら、ホスホリパーゼA2による膜リン脂質からの遊離に続いて、PUFAの様々なタイプの脂質メディエーターへの変換は、多くの酵素によって触媒される⁴⁸。さらに、これらのPUFAは、シクロオキシゲナーゼ(COX)−1およびCOX-2酵素の作用 を介して 、炎症誘発性および抗炎症性プロスタグランジンの産生のための基質となり得る⁴⁷。リン脂質は、これらのメディエーターが生物学的効果を実証するために必要な特定の場所で放出される脂質メディエーターの供給源の1つです。

肺は複数の細胞型からなる複雑な器官であり、それぞれが正常な肺の発達と機能を促進する上で重複したニッチな役割を果たしています。マウスまたはヒトの肺の異なる細胞型(肺胞2型細胞など)を分離してプロファイリングするための研究はごくわずかです^49,50;他の主要な肺細胞タイプは特徴付けられていません。.別の興味深い研究⁵¹は、マウス肺の内皮、上皮、間葉系、および混合免疫細胞の脂質分析を単離して実行するために実施されました。PCOおよびPGに取り込まれたPUFAの濃度が免疫細胞に富んでいることが観察された。気管支肺胞洗浄(BAL)⁵²によって評価されるように、CSが肺内の免疫細胞の増加(4〜5倍)を誘導するという事実を考慮すると、この研究で観察された総脂質変化は、マウス肺における免疫細胞動員の累積的な増加によって説明できます。

結論として、リン脂質に取り込まれた一価不飽和脂肪酸およびPUFAの観察された歪みは、細胞内の特定のFAの過剰を反映し、および/または酸化ストレスおよび炎症条件下で過剰に産生されるオキシリピン前駆体の細胞内資源を構成する可能性がある。ただし、遊離EPA、DHA、およびその他のオキシリピンに関する追加データは、この点を明確にするために不可欠であり、現在の方法の適用範囲外です。