توليد الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة الحبل السري البشري وتمايزها في سلالة العضلات الهيكلية
Summary
نحن نصف بروتوكولا لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة الحبل السري البشري وتمايزها في سلالة العضلات الهيكلية.
Abstract
يعتمد استكشاف الإمكانات العلاجية للخلايا الجذعية الوسيطة على سهولة العزلة والفعالية نحو التمايز وموثوقية ومتانة المصدر. نصف هنا بروتوكولا تدريجيا لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة عن أنسجة الحبل السري البشري (uMSCs) ، وتنميطها المناعي ، وانتشار هذه الثقافات عبر عدة ممرات. في هذا الإجراء ، تكون صلاحية uMSCs عالية لأنه لا يوجد هضم إنزيمي. علاوة على ذلك ، فإن إزالة الأوعية الدموية ، بما في ذلك شرايين الحبل السري والوريد ، تضمن عدم وجود تلوث للخلايا ذات الأصل البطاني. باستخدام قياس التدفق الخلوي ، تكون uMSCs عند العزل CD45−CD34− ، مما يشير إلى عدم وجود خلايا من سلالة المكونة للدم. الأهم من ذلك ، أنها تعبر عن علامات السطح الرئيسية ، CD105 ، CD90 ، و CD73. عند إنشاء الثقافات ، تصف هذه الورقة طريقة فعالة للحث على التمايز في هذه uMSCs في سلالة العضلات الهيكلية. يكشف تحليل مفصل للتقدم العضلي في uMSCs المتمايزة أن uMSCs تعبر عن Pax7 ، وهي علامة للأسلاف العضلية المنشأ في المراحل الأولية من التمايز ، تليها التعبير عن MyoD و Myf5 ، وأخيرا ، علامة تمايز طرفية ، سلسلة الميوسين الثقيلة (MyHC).
Introduction
يعود الفضل إلى الحبل السري البشري في امتلاك خزان قوي من الخلايا الجذعية الوسيطة ، والتي يتم استكشافها حاليا للعلاجات التجديدية بسبب معدلات انتشارها وتمايزها القوية ، وخصائصها المناعية ، وقدرتها على توليد الخلايا من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث1. يتكون نسيج الحبل السري من مقصورات متعددة مثل دم الحبل السري، وبطانة الوريد السري الفرعية، وهلام وارتون (WJ)، والذي يشمل في حد ذاته ثلاث مناطق غير واضحة – المنطقة المحيطة بالأوعية الدموية، والمنطقة بين الأوعية الدموية، والسلى الفرعي أو بطانة الحبل السري (CL)2. في حين يمكن عزل uMSCs عن كل هذه المناطق المختلفة والتعبير على نطاق واسع عن علامات MSC الرئيسية ، لا يوجد وضوح حول ما إذا كانت هذه المقصورات تحتوي على نفس عدد السكان من uMSCs أو تعرض اختلافات في قدرات التمايز الخاصة بها3. وبالتالي ، تتطلب بروتوكولات عزل uMSCs دقة أكبر في أسلوبها ومنطقة عزلتها ، والتوصيف القوي لإمكانات التمايز ، وأخيرا ، تحليل مقارن من مقصورات مختلفة من الحبل.
في هذا السياق ، أظهرت دراسات قليلة اختلافات في إمكانات uMSC التكاثرية والتفاضلية بين أجزاء مختلفة من الحبل. ومن بين هذه الوسائل، كشفت التحليلات المقارنة بين uMSCs المعزولة من منطقتي CL و WJ عن إمكانات تكاثرية أكبر في uMSCsالمشتقة من CL 3,4. وفي دراسة منفصلة، كان أداء uMSCs المشتقة من WJ أفضل في مقايسات الانتشار مقارنة بالخلايا المحيطة بالأوعية الدموية (HUCPV)5. عند فحص الاختلافات بين uMSCs المشتقة من دم الحبل السري و uMSCs المشتقة من أنسجة الحبل السري الخالية من تلوث الأوعية الدموية ، تم الإبلاغ عن التعبير التفاضلي لعلامات MSC الرئيسية بين المقصورتين ، بالإضافة إلى زيادة معدلات الانتشار في uMSCs المشتقة من أنسجة الحبلالسري 6.
من بين العديد من الدراسات التي تدرس إمكانات التمايز ل uMSCs في المقام الأول في أنسجة سلالة الأديم المتوسط مثل السلالات العظمية والشحمية والغضروفية ، قدم عدد قليل جدا بروتوكولات مفصلة للتمايز العضلي والتوصيف اللاحق ، بالإضافة إلى تحليلات مقارنة بين مقصورات الحبل المختلفة. في هذا السياق ، قمنا بتطوير بروتوكول قوي لتمايز العضلات ولاحظنا أن uMSCs المشتقة من أنسجة الحبل السري تظهر قدرات تمايز عضلي المنشأ متفوقة مقارنة بدم الحبل السري6. هنا ، يتم تفصيل بروتوكول تدريجي لعزل uMSCs عن أنسجة الحبل السري بأكملها الخالية من الخلايا المرتبطة بالأوعية الدموية ، وتوصيفها ، وتمايزها في السلالة العضلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوات حاسمة
تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول في جمع الأنسجة في ظل ظروف معقمة ، من وقت التسليم إلى صيانة الثقافات المعقمة ، طوال مدة الانتشار. أثناء جمع الحبل ، من الضروري ألا يلمس الحبل أي سطح غير معقم ويتم مسحه خارجيا بالإيثانول بنسبة 70٪ قبل جمعه في أنابيب تحتوي على …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر السيد أوخاس تيكو على مساعدته في التصوير وإنتاج الفيديو. كما نعترف بالمساعدة التي تلقيناها من موظفي GARBH-Ini (المجموعة متعددة التخصصات المعنية بالبحوث المتقدمة ونتائج الولادة – DBT India) والممرضات وكبار مسؤولي الأبحاث في مستشفى Gurugram المدني والدكتور Pallavi Kshetrapal للمساعدة في الخدمات اللوجستية. وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح المقدمة إلى سوتشيترا جوبيناث من إدارة التكنولوجيا الحيوية، الهند (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton’s jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
- Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
- Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton’s Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
- Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton’s jelly. BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).
- Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton’s jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
- Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
