Kromoforların Varlığında ve Yokluğunda Cu(II) ve Peptit Kalıntıları Arasındaki Bağlanma Etkileşimlerinin Ölçülmesi
Summary
Bu makale, peptitlere ve proteinlere bağlanan Cu(II)’nin termodinamiğini araştırmak ve ölçmek için elektronik absorpsiyon spektroskopisi ve izotermal titrasyon kalorimetrisinin kullanımına odaklanmaktadır.
Abstract
Bakır (II), biyolojik sistemlerde temel bir metaldir ve etkileşime girdiği biyomoleküllere benzersiz kimyasal özellikler kazandırır. Çeşitli peptitlere doğrudan bağlandığı ve aracılık yapısından elektron transfer özelliklerine ve katalitik fonksiyon vermeye kadar hem gerekli hem de patolojik rolleri oynadığı bildirilmiştir. Bu Cu(II)-peptid komplekslerinin in vitro bağlanma afinitesini ve termodinamiğini ölçmek, bağlanmanın termodinamik itici gücü, peptid için farklı metal iyonları veya Cu(II) için farklı peptitler arasındaki potansiyel rekabetler ve in vivo olarak Cu(II)-peptid kompleksinin prevalansı hakkında fikir verir. Bununla birlikte, bağlayıcı termodinamiğin nicelleştirilmesi, özellikle peptidi, d-blok metal iyonunu ve bunların etkileşimlerini temsil eden ayrı spektroskopik tutamakların bulunmadığı durumlarda, bir titrasyon deneyi içindeki tüm rakip dengelerin hesaplanması da dahil olmak üzere sayısız faktör nedeniyle zor olabilir.
Burada, Cu (II) -peptid termodinamiğinin doğru bir şekilde ölçülmesi için sağlam bir deney seti sağlanmıştır. Bu makalede, Cu(II) üzerinde gerekli spektroskopik tutamağı sağlamak için kromoforik ligandların varlığında ve yokluğunda elektronik absorpsiyon spektroskopisinin kullanımı ve etiketsiz izotermal titrasyon kalorimetrisinin kullanımı üzerinde durulmaktadır. Her iki deneysel teknikte de, tüm rakip dengeleri hesaba katacak bir süreç tanımlanmıştır. Bu makalenin odak noktası Cu(II) üzerinde olsa da, açıklanan deney seti Cu(II)-peptid etkileşimlerinin ötesine geçebilir ve fizyolojik olarak ilgili koşullar altında diğer metal-peptid sistemlerinin doğru bir şekilde ölçülmesi için bir çerçeve sağlayabilir.
Introduction
Biyoloji, yaşamın çevresindeki çevreye uyum sağlaması ve hayatta kalması için gereken metal iyonlarının çeşitli kimyasını kullanmak için gelişmiştir. Proteinlerin tahmini% 25 -% 50’si yapı ve işlev için metal iyonları kullanır1. Metal iyonunun özel rolü ve redoks durumu, onu koordine eden biyolojik ligandların bileşimi ve geometrisi ile doğrudan ilgilidir. Ek olarak, Cu(II) gibi redoks-aktif metal iyonları, reaktif oksijen türleri (ROS) 2,3,4 oluşturmak için Fenton benzeri kimya yoluyla oksitleyici ajanlarla etkileşime girmemeleri için sıkı bir şekilde düzenlenmelidir. Biyokimyasını yönlendiren bağlanma modlarını ve afinitesini anlamak, metal iyonunun biyolojik rolünü aydınlatmaya yardımcı olmalıdır.
Metallerin ve peptitlerin bağlanma etkileşimlerini incelemek için birçok teknik kullanılır. Bunlar çoğunlukla spektroskopik tekniklerdir, ancak aynı zamanda bir amiloid beta (Aβ) 5 parçası ile Cu (II) etkileşimlerinde görüldüğü gibi moleküler dinamiği kullanan bilgisayar simülasyonlarını da içerir. Birçok üniversite tarafından erişilebilen yaygın olarak kullanılan spektroskopik bir teknik, nükleer manyetik rezonanstır (NMR). Cu (II)’nin paramanyetik doğasını kullanarak, Gaggelli ve ark. metal iyonunun yakındaki çekirdekleringevşemesi yoluyla bir petide nereye bağlandığını gösterebildiler 6. Elektron paramanyetik rezonansı (EPR), paramanyetik metal iyonu bağlama7’nin yerini ve modunu araştırmak için de kullanılabilir. Dairesel dikroizm (CD) gibi diğer spektroskopik teknikler, tripeptit sistemleri8 gibi sistemlerde Cu(II) ile ilgili koordinasyonu tanımlayabilir ve kütle spektrometrisi stokiyometriyi ve metal iyonunun parçalanma kalıpları 9,10 ile hangi kalıntıların koordine edildiğini gösterebilir.
NMR gibi bu tekniklerden bazıları etiketsizdir, ancak büyük konsantrasyonlarda peptid gerektirir ve bu da çalışma için zorluklar yaratır. Floresan spektroskopisi adı verilen bir başka yaygın teknik, bir tirozin veya triptofanın pozisyonunu bir Cu(II)11,12’den söndürme ile ilişkilendirmek için kullanılmıştır. Benzer şekilde, bu teknik Cu(II) bağlama13’ün bir sonucu olarak yapısal değişiklikler gösterebilir. Bununla birlikte, bu metal-peptit bağlama çalışmalarındaki zorluklar, tüm sistemlerin sahip olmadığı tirozin gibi kromoforik amino asitleri araştırmaları, metal iyonunun klasik bir model altında bağlanması ve tekniğin fizyolojik koşullar altında elverişli olmayabilmesidir. Gerçekten de, bu tür kromoforik amino asitleri içermeyen veya klasik modellere bağlanmayan, bu tekniklerin kullanılmasını engelleyen birkaç peptit ortaya çıkmaktadır14,15. Bu makalede, fizyolojik olarak ilgili koşullar altında bu senaryolardaki bağlanma özelliklerini değerlendirmek için yaklaşımlar ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Biyolojik ligandlar, histidin üzerindeki imidazol halkası gibi metal iyon bağlanmasını etkileyebilecek farklı protonasyon durumlarını benimseyebilir. pH tutarlı bir şekilde korunmazsa, sonuçlar kıvrımlı veya çelişkili olabilir. Bu nedenle, tamponlar metal-protein / peptit etkileşimlerinin incelenmesinde önemli bir bileşendir. Bununla birlikte, birçok tamponun metal iyonları16,17 ile olumlu etkileşime girdiği gösterilmiştir. İlgilenilen biyolojik molekülle rekabet etmenin yanı sıra, tampon, peptid veya proteinin koordine edici atomlarından ayırt edilmesi zor olabilecek benzer koordine edici atomlara sahip olabilir. Bu çalışmada, tampon seçimi ile ilgili özel hususlar göz önünde bulundurularak, Cu(II)-peptid etkileşimlerini incelemek için iki tamamlayıcı teknik olarak elektronik absorpsiyon spektroskopisi ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) üzerinde durulmuştur.
Elektronik absorpsiyon spektroskopisi, metal bağlama etkileşimlerini incelemek için hızlı, yaygın olarak erişilebilir bir tekniktir. Ultraviyole (UV) veya görünür dalga boylarında ışıkla ışınlama, ligand sınıflandırması, metal geometrileri ve görünür bağlanma afiniteleri hakkında değerli bilgiler sağlayan metal merkezli d-d bantlarının emilimine yol açabilir18,19. Bu kompleksler için, metal iyonlarının protein veya peptit çözeltilerine doğrudan titrasyonları, bağlanma stokiyometrilerini ve görünür bağlanma afinitelerini ölçebilir. D5 veya d10 elektron konfigürasyonları gibi bazı durumlarda, kompleks ışığı emmez (yani, spektroskopik olarak sessizdir). Bu spektroskopik olarak sessiz geçiş metal komplekslerinde, bu sınırlamalar, metal iyonuna koordine edildikten sonra, tespit edilebilir yük transfer bantları veren rakip bir ligand kullanılarak aşılabilir. Her iki durumda da, bu yaklaşım sadece stokiyometriyi ve görünür bağlanma afinitesini ölçmekle sınırlıdır ve bağlayıcı entalpiye ilişkin hiçbir içgörü yaklaşımlar olmadan sağlanmamıştır.
Elektronik absorpsiyon spektroskopisinden elde edilen bilgileri tamamlayan ITC, bağlayıcı entalpi20’nin doğrudan ve titiz bir şekilde ölçülmesi için çekici bir tekniktir. ITC, bir bağlama olayı sırasında salınan veya tüketilen ısıyı doğrudan ölçer ve titrasyon sabit basınçta gerçekleştiği için ölçülen ısı, tüm dengelerin entalpisidir (ΔHITC). Ek olarak, bağlanma olayının (n) stokiyometrisi ve görünür bağlanma afinitesi (KITC) ölçülür. Bu parametrelerden, serbest enerji (ΔG ITC) ve entropi (ΔSITC) belirlenir ve bağlanma olayının termodinamik bir anlık görüntüsü sağlanır. Işık emilimine dayanmadığı için ITC, spektroskopik olarak sessiz türler, örneğin d5 veya d10 metal iyon kompleksleri için ideal bir tekniktir. Bununla birlikte, kalorimetri ısıyı ölçtüğünden, herhangi bir eşsiz tampon sistemi ve hesaplanmamış denge, metal iyonu bağlayıcı termodinamiği doğru bir şekilde belirlemek için analizi olumsuz yönde etkileyebilir ve bu faktörleri ele almak için büyük özen gösterilmelidir20. Uygun titizlikle gerçekleştirilirse, ITC metal-protein / peptit komplekslerinin termodinamiğini belirlemek için sağlam bir tekniktir.
Burada, iki tekniğin tamamlayıcı kullanımını göstermek için kromoforik olarak sessiz bir bakır bağlayıcı peptid olan C-peptid kullanılır. C-peptid, insülin olgunlaşması sırasında oluşan 31 kalıntı bölünme ürünüdür (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ); kromoforik kalıntılardan yoksundur, ancak Cu(II)’yi fizyolojik olarak ilişkili afinite14,15 ile bağladığı gösterilmiştir. Cu (II) bağlanma bölgesi, bir glutamat ve bir aspartatın yan zincirlerinden ve ayrıca peptid 14,15’in N-terminusundan oluşur. Bu koordine edici atomlar, yaygın olarak kullanılan birçok tamponlu sisteminkine çok benzer. Burada, elektronik absorpsiyon spektroskopisinde d-d ve yük transfer bantlarının ve ITC’nin C-peptide bağlanan Cu (II) termodinamiğini ölçmede tandem kullanımı gösterilmiştir. Cu(II) bağlanmasının C-peptide bağlanmasını incelemekten yaklaşım, diğer metal iyonlarına ve protein / peptid sistemlerine uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makale, peptitlere bağlanan Cu(II)’nin afinitesini ve termodinamiğini ölçmek için sağlam bir yöntem sunmaktadır. Cu(II) içeren kompleksler, d9 elektron konfigürasyonu nedeniyle metal sahasındaki d-d absorpsiyon bandını izlemek için idealdir. Her ne kadar yok olma katsayısı küçük olsa da, bu nedenle güvenilir bir sinyal vermek için kompleksin daha büyük konsantrasyonlarını gerektirse de, Cu(II)’nin peptide titrasyonları, bağlanma stokiyometrisi ve yaklaşık bağlanma afinitesi hak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SC, Whitehead Yaz Araştırma Bursu’na teşekkür eder. MJS, San Francisco Üniversitesi’ndeki Başlangıç Fonlarına ve Fakülte Geliştirme Fonu’na teşekkür eder. MCH, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH MIRA 5R35GM133684-02) ve Ulusal Bilim Vakfı’ndan (NSF KARİYER 2048265) gelen fonları kabul etmektedir.
Materials
| 1,10-phenanthroline | Sigma Aldrich | 131377-25G | |
| bis-Tris buffer | Fisher | BP301-100 | |
| Bottle-top 0.45 micron membrane | Nalgene | 296-4545 | Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable |
| Copper(II) chloride | Alfa Aesar | 12458 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-500G | |
| Electronic absorption spectrophotometer | Varian | Cary 5000 | Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable |
| high affinity resin | Sigma Aldrich | C7901-25G | |
| Isothermal titration calorimeter (ITC) | TA Instruments | Nano ITC Low Volume | |
| ITC analysis software | TA Instruments | NanoAnalyze | SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used |
| ITC software | TA Instruments | ITCRun | |
| light-duty delicate wiper | Kimwipe | 34155 | |
| loading syringe | Hamilton | Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL | |
| matched cuvettes | Starna Cells, Inc | 16.100-Q-10/Z20 | Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer |
| MOPS buffer | Alfa Aesar | A12914 | |
| spectrophotometer software | Cary | WinUV Scan | |
| spreadsheet program | Microsoft | Excel | Any suitable spreadsheet program will work |
| titration syringe | TA Instruments | 5346 | |
| ultrapure water | Millipore Sigma | Milli-Q | Any water is okay as long as >18 MΩ resistance |
References
- Waldron, K. J., Robinson, N. J. How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal. Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).
- Puig, S., Thiele, D. J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).
- Huffman, D. L., O’Halloran, T. V. Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).
- Kaplan, J. H., Lutsenko, S. Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs. Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).
- Makowska, J., et al. Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the Aβ (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations. Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).
- Gaggelli, E., D’Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. 1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides. Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).
- García, J. E., et al. Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106−115: evaluating the role of protons and methionine residues. Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).
- Jakab, N. I., et al. Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy. Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).
- Keltner, Z., et al. Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants. Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).
- Whittal, R. M., et al. a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry. Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).
- Żamojć, K., et al. A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).
- Beuning, C. N., et al. Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-β complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching. Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).
- Makowska, J., Żamojć, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzyński, L. Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus. Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).
- Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization. ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).
- Stevenson, M. J., et al. Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity. Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).
- Magyar, J. S., Godwin, H. A. Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects. Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).
- Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions – a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
- Sigel, H., Martin, R. B. Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands. Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).
- Liu, J., et al. Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers. Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).
- Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).
- Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. . Inorganic Chemistry. , (2014).
- Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system. Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).
- Kocyła, A., Pomorski, A., Krężel, A. Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications. Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).
- Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. SEDPHAT – A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions. Methods. 76, 137-148 (2015).
- NIST. . Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).
- Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman’s reagent and with 4,4′-dithiodipyridine. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
