Quantificando as interações de ligação entre os resíduos de(II) e Peptídeos na Presença e Ausência de Cromóforos

A biologia evoluiu para utilizar a diversificada química dos íons metálicos necessários para que a vida se adapte e sobreviva em seu ambiente circundante. Estima-se que 25%-50% das proteínas usam íons metálicos para estrutura e função¹. O papel particular e o estado redox do íon metálico estão diretamente relacionados com a composição e geometria dos ligantes biológicos que o coordenam. Além disso, íons metálicos ativos de redox, como(II), devem ser fortemente regulados para que não interajam com agentes oxidantes através da química fenton para formar espécies reativas de oxigênio (ROS)^2,3,4. Compreender os modos de ligação e afinidade que impulsionam sua bioquímica deve ajudar a elucidar o papel biológico do íon metálico.

Muitas técnicas são utilizadas para estudar as interações vinculantes de metais e peptídeos. Estas são principalmente técnicas espectroscópicas, mas também incluem simulações de computador usando dinâmica molecular, como visto através de interações(II) com um fragmento de beta amiloide (Aβ)⁵. Uma técnica espectroscópica amplamente utilizada que é acessível a muitas universidades é a ressonância magnética nuclear (RMN). Usando a natureza paramagnética de(II), Gaggelli et al. foram capazes de mostrar onde o íon metálico se liga a um petide através do relaxamento dos núcleos^{próximos 6}. A ressonância paramagnética eletrônica (EPR) também pode ser utilizada para sondar a localização e o modo da ligação de íon metálico paramagnético⁷. Outras técnicas espectroscópicas, como o dicromaísmo circular (CD) podem descrever a coordenação sobre(II) em sistemas como sistemas tripeptídeos⁸, e espectrometria de massa pode mostrar estequiometria e para que resíduos o íon metálico seja coordenado através de padrões de fragmentação ^9,10.

Algumas dessas técnicas, como a RMN, são livres de rótulos, mas exigem grandes concentrações de peptídeos, colocando desafios para o estudo. Outra técnica comum chamada espectroscopia de fluorescência tem sido utilizada para relacionar a posição de uma tirasina ou triptofano com a sacieçação de um(II)^11,12. Da mesma forma, esta técnica pode apresentar alterações estruturais como resultado da ligação(II^{) 13}. No entanto, os desafios com esses estudos de ligação metal-peptídeo são que eles sondam aminoácidos cromofóricos, como a tyrosina que nem todos os sistemas têm, que o íon metálico se liga sob um modelo clássico, e que a técnica pode não ser propícia em condições fisiológicas. De fato, existem vários peptídeos que não contêm tais aminoácidos cromofóricos ou se ligam sob modelos clássicos, impedindo o uso dessas técnicas^14,15. Este artigo detalha abordagens para avaliar propriedades vinculantes nesses cenários em condições fisiologicamente relevantes.

Ligantes biológicos podem adotar diferentes estados de protonação que podem afetar a ligação de íons metálicos, como o anel de imidazol na histidina. Se o pH não for mantido de forma consistente, os resultados podem ser complicados ou conflitantes. Por essa razão, os buffers são um componente essencial no estudo das interações metal-proteína/peptídeo. No entanto, muitos buffers têm sido mostrados para interagir favoravelmente com íons metálicos^16,17. Além de competir com a molécula biológica de interesse, o tampão pode ter átomos coordenados semelhantes que podem ser difíceis de distinguir dos átomos coordenadores do peptídeo ou proteína. Neste estudo, o foco está na espectroscopia de absorção eletrônica e calorimetria isotemal de titulação (ITC) como duas técnicas complementares para o estudo das interações(II)-peptídeos, com considerações especiais sobre a escolha do tampão.

A espectroscopia de absorção eletrônica é uma técnica rápida e amplamente acessível para estudar interações de ligação metálica. A irradiação com luz no comprimento de onda ultravioleta (UV) ou visível pode levar à absorção de bandas d-d centradas no metal, que fornecem informações valiosas sobre classificação de ligantes, geometrias metálicas e afinidades de ligação aparente^18,19. Para esses complexos, as titulações diretas de íons metálicos em soluções de proteína ou peptídeo podem quantificar estoquitometrias vinculantes e afinidades aparentes de ligação. Em alguns casos, como configurações de⁵ ou^{d 10} elétrons, o complexo não absorve luz (ou seja, é espectroscopicamente silencioso). Nestes complexos metálicos de transição espectroscópicamente silenciosos, essas limitações podem ser contornadas usando um ligante concorrente que, ao coordenar para o íon metálico, produz faixas detectáveis de transferência de carga. Em ambos os casos, esta abordagem limita-se a quantificar apenas a estequiometria e a afinidade de ligação aparente, e nenhuma percepção sobre a entalpia vinculante é fornecida sem aproximações.

Complementando informações obtidas a partir da espectroscopia de absorção eletrônica, o ITC é uma técnica atraente para quantificação direta e rigorosa da ligação^{enthalpy 20}. O ITC mede diretamente o calor liberado ou consumido durante um evento de ligação e, uma vez que a titulação ocorre em pressão constante, o calor medido é a entalpia de todo o equilíbrio (ΔH_ITC). Além disso, quantificam-se a estequiometria do evento de ligação (n) e a aparente afinidade de ligação (K_ITC). A partir desses parâmetros, a energia livre (ΔG_ITC) e a entropia (ΔS_ITC) são determinadas, fornecendo um instantâneo termodinâmico do evento de ligação. Como não depende da absorção de luz, o ITC é uma técnica ideal para espécies espectroscopicamente silenciosas, por exemplo, d⁵ ou d¹⁰ peles de íons metálicos. No entanto, uma vez que a calorimetria mede o calor, qualquer sistema tampão incomparável e equilíbrio não contabilizado pode afetar negativamente a análise para determinar com precisão a termodinâmica de ligação de íons metálicos, e muito cuidado deve ser tomado para lidar com esses fatores²⁰. Se realizado com o rigor adequado, o ITC é uma técnica robusta para determinar a termodinâmica dos complexos metal-proteína/peptídeo.

Aqui, um peptídeo de ligação de cobre cromoohoricamente silencioso, C-peptídeo, é usado para demonstrar o uso complementar das duas técnicas. C-peptídeo é um produto de decote de resíduos (EAEDLQVGQGQGGGGGLQPLALEGSLQ) formado durante a maturação da insulina; não possui resíduos cromofóricos, mas tem se mostrado que liga(II) com afinidade fisiologicamente relevante^14,15. O sítio de ligação(II) consiste nas cadeias laterais de um glutamato e um aspartato, bem como o N-terminus do peptídeo ^14,15. Estes átomos coordenadores se assemelham muito aos de muitos sistemas tamponados comumente usados. Aqui, é mostrado o uso tandem das bandas d-d e transferência de carga em espectroscopia de absorção eletrônica e ITC na quantificação da termodinâmica de ligação(II) para C-peptídeo. A abordagem do estudo(II) vinculativo ao C-peptídeo pode ser aplicada a outros íons metálicos e sistemas de proteína/peptídeo.