Quantificare le interazioni di legame tra Cu(II) e residui peptidici in presenza e assenza di cromofori

La biologia si è evoluta per utilizzare la diversa chimica degli ioni metallici necessari alla vita per adattarsi e sopravvivere nell’ambiente circostante. Si stima che il 25%-50% delle proteine utilizzi ioni metallici per la struttura e la funzione¹. Il particolare ruolo e stato redox dello ione metallico è direttamente correlato alla composizione e alla geometria dei ligandi biologici che lo coordinano. Inoltre, gli ioni metallici redox-attivi come Cu(II) devono essere strettamente regolati per timore che interagiscano con agenti ossidanti attraverso la chimica simile a Fenton per formare specie reattive dell’ossigeno (ROS)^2,3,4. Comprendere i modi di legame e l’affinità che guidano la sua biochimica dovrebbe aiutare a chiarire il ruolo biologico dello ione metallico.

Molte tecniche sono utilizzate per studiare le interazioni di legame di metalli e peptidi. Queste sono per lo più tecniche spettroscopiche, ma includono anche simulazioni al computer che utilizzano la dinamica molecolare, come visto attraverso le interazioni Cu (II) con un frammento di amiloide-beta (Aβ) ⁵. Una tecnica spettroscopica ampiamente utilizzata che è accessibile a molte università è la risonanza magnetica nucleare (NMR). Usando la natura paramagnetica di Cu(II), Gaggelli et al. sono stati in grado di mostrare dove lo ione metallico si lega su un petide attraverso il rilassamento dei nuclei vicini⁶. La risonanza paramagnetica elettronica (EPR) può anche essere utilizzata per sondare la posizione e la modalità del legame ionico metallico paramagnetico⁷. Altre tecniche spettroscopiche come il dicroismo circolare (CD) possono descrivere il coordinamento su Cu(II) in sistemi come i sistemi tripartitici⁸, e la spettrometria di massa può mostrare stechiometria e a quali residui lo ione metallico è coordinato attraverso modelli di frammentazione ^9,10.

Alcune di queste tecniche, come la NMR, sono prive di etichette ma richiedono grandi concentrazioni di peptide, ponendo sfide per lo studio. Un’altra tecnica comune chiamata spettroscopia di fluorescenza è stata utilizzata per mettere in relazione la posizione di una tirosina o triptofano con la tempra da un Cu(II)^11,12. Allo stesso modo, questa tecnica può mostrare cambiamenti strutturali come risultato del legame Cu(II)¹³. Tuttavia, le sfide con questi studi di legame metallo-peptide sono che sondano gli amminoacidi cromoforici come la tirosina che non tutti i sistemi hanno, che lo ione metallico si lega sotto un modello classico e che la tecnica potrebbe non essere favorevole in condizioni fisiologiche. In effetti, stanno emergendo diversi peptidi che non contengono tali amminoacidi cromoforici o si legano sotto modelli classici, precludendo l’uso di queste tecniche^14,15. Questo articolo descrive in dettaglio gli approcci per valutare le proprietà di legame in questi scenari in condizioni fisiologicamente rilevanti.

I ligandi biologici possono adottare diversi stati di protonazione che possono influenzare il legame con ioni metallici come l’anello imidazolo sull’istidina. Se il pH non viene mantenuto in modo coerente, i risultati possono essere contorti o conflittuali. Per questo motivo, i tamponi sono una componente essenziale nello studio delle interazioni metallo-proteina/peptide. Tuttavia, molti buffer hanno dimostrato di interagire favorevolmente con gli ioni metallici^16,17. Oltre a competere con la molecola biologica di interesse, il buffer può avere atomi di coordinamento simili che possono essere difficili da distinguere dagli atomi coordinati del peptide o della proteina. In questo studio, l’attenzione si concentra sulla spettroscopia di assorbimento elettronico e sulla calorimetria a titolazione isotermica (ITC) come due tecniche complementari per lo studio delle interazioni Cu(II)-peptide, con considerazioni speciali riguardanti la scelta del tampone.

La spettroscopia elettronica di assorbimento è una tecnica rapida e ampiamente accessibile per lo studio delle interazioni metallo-legame. L’irradiazione con la luce nelle lunghezze d’onda ultraviolette (UV) o visibili può portare all’assorbimento di bande d-d centrate sul metallo, che forniscono preziose informazioni sulla classificazione dei ligandi, sulle geometrie dei metalli e sulle apparenti affinità di legame^18,19. Per questi complessi, le titolazioni dirette di ioni metallici in soluzioni proteiche o peptidiche possono quantificare le stechiometrie di legame e le apparenti affinità di legame. In alcuni casi, come le configurazioni di elettroni d⁵ o d¹⁰, il complesso non assorbe la luce (cioè è spettroscopicamente silenzioso). In questi complessi di metalli di transizione spettroscopicamente silenziosi, queste limitazioni possono essere aggirate utilizzando un ligando concorrente che, coordinandosi con lo ione metallico, produce bande di trasferimento di carica rilevabili. In entrambi i casi, questo approccio si limita a quantificare solo la stechiometria e l’apparente affinità di legame, e nessuna comprensione dell’entalpia di legame è fornita senza approssimazioni.

Integrando le informazioni ottenute dalla spettroscopia elettronica di assorbimento, l’ITC è una tecnica interessante per la quantificazione diretta e rigorosa dell’entalpia^{di legame 20}. ITC misura direttamente il calore rilasciato o consumato durante un evento legante e, poiché la titolazione avviene a pressione costante, il calore misurato è l’entalpia di tutti gli equilibri (ΔH_ITC). Inoltre, la stechiometria dell’evento di legame (n) e l’apparente affinità di legame (K_ITC) sono quantificate. Da questi parametri vengono determinate l’energia libera (ΔG_ITC) e l’entropia (ΔS_ITC), fornendo un’istantanea termodinamica dell’evento di legame. Poiché non si basa sull’assorbimento della luce, ITC è una tecnica ideale per specie spettroscopicamente silenziose, ad esempio complessi di ioni metallici d⁵ o d¹⁰ . Tuttavia, poiché la calorimetria misura il calore, qualsiasi sistema tampone senza pari e gli equilibri non contabilizzati possono influire negativamente sull’analisi per determinare con precisione la termodinamica legante gli ioni metallici e occorre prestare molta attenzione per affrontare questi fattori²⁰. Se eseguita con il rigore appropriato, l’ITC è una tecnica robusta per determinare la termodinamica dei complessi metallo-proteina/peptide.

Qui, un peptide legante il rame cromoforicamente silenzioso, il peptide C, viene utilizzato per dimostrare l’uso complementare delle due tecniche. Il peptide C è un prodotto di scissione di 31 residui (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) formato durante la maturazione dell’insulina; manca di residui cromoforici ma ha dimostrato di legare Cu(II) con affinità fisiologicamente rilevante^14,15. Il sito di legame Cu(II) è costituito dalle catene laterali di un glutammato e di un aspartato, nonché dall’N-terminale del peptide^14,15. Questi atomi di coordinamento assomigliano molto a quelli di molti sistemi tamponati comunemente usati. Qui, viene mostrato l’uso in tandem delle bande d-d e di trasferimento di carica nella spettroscopia elettronica di assorbimento e ITC nel quantificare la termodinamica di legame Cu(II) al peptide C. L’approccio derivante dallo studio del legame di Cu(II) al peptide C può essere applicato ad altri ioni metallici e sistemi proteici/peptidici.