MicroRNA 처리 후 Murine Müller Glia의 재생 잠재력을 연구하기 위한 일차 세포 배양
Summary
마우스 망막으로부터 수득된 뮐러 글리아 일차 배양물은 마이크로RNA 처리 후 망막 전구 세포로의 신경교세포 전환을 연구하는 매우 강력하고 신뢰할 수 있는 도구를 나타낸다. 단일 분자 또는 조합물은 생체내 접근법의 후속 적용 전에 시험될 수 있다.
Abstract
뮐러 글리아 (MG)는 신경 망막에서 우세한 아교 세포이며 망막 뉴런의 재생 원으로 기능 할 수 있습니다. 물고기와 같은 하부 척추 동물에서는 MG 구동 재생이 자연적으로 발생합니다. 그러나 포유류에서는 특정 요인에 대한 자극이나 유전 적 / 후성 유전 적 조작이 필요합니다. MG는 망막 세포 집단의 단지 5%만을 구성하기 때문에, 이 세포 집단의 연구를 배타적으로 허용하는 모델 시스템에 대한 필요성이 존재한다. 이러한 모델 시스템 중 하나는 재현 가능한 일차 MG 배양물이며 분자/인자 스크리닝 및 식별, 화합물 또는 인자 테스트, 세포 모니터링 및/또는 기능 테스트를 포함한 다양한 용도에 사용할 수 있습니다. 이 모델은 인공 miRNA 또는 그의 억제제의 형질감염을 통해 마이크로RNA (miRNAs)의 보충 또는 억제 후에 망막 뉴런으로 전환하는 뮤린 MG의 잠재력을 연구하는 데 사용된다. MG 특이적 리포터 마우스를 면역형광 표지 및 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)과 병용하여 이들 배양물에서 발견된 세포의 80%-90%가 MG임을 확인하였다. 이 모델을 사용하여 miRNA는 MG를 망막 전구 세포(RPCs)로 재프로그래밍할 수 있으며, 이는 이어서 신경유사 세포로 분화된다. 이 기술의 장점은 miRNA 후보가 생체 내 적용에서 사용하기 전에 효율성과 결과에 대해 테스트 할 수 있다는 것입니다.
Introduction
뮐러 글리아교(MG)는 신경망막에서 우세한 신경교세포입니다. 그들은 물과 이온 항상성 유지, 뉴런 영양 공급 및 조직 보호와 같은 중추 신경계의 다른 부위의 다른 아교세포에 비해 유사한 기능을 가지고 있습니다. MG는 또 다른 매혹적인 특징을 가지고 있습니다 : 성숙한 아교 세포이지만 발달 후반 동안 망막 전구 세포 (RPC)에서 발현되는 많은 유전자를 여전히 발현합니다 1,2. 이러한 유사성은 망막 손상 후 어망막에서 자연적으로 발생하는 MG계 신경세포 재생의 원인으로 가정된다3,4. 이 과정 동안, MG는 세포 주기에 다시 들어가고 RPC로 탈분화된 다음, 여섯 가지 유형의 망막 뉴런으로 분화된다. 이 현상은 물고기에서 자연적으로 발생하지만, 포유류 MG는 뉴런 5,6으로 변환되지 않습니다. 그러나 다시 프로그래밍 할 수 있습니다. MG를 RPC / 뉴런으로 재 프로그래밍하는 다양한 요인이 나타났습니다. 이들 인자 중에는 어류 재생 7,8에 관여하는 기본적인 나선-루프-나선 (bHLH) 전사 인자 achaete-scute homolog 1 (Ascl1)이 있다. 마우스에서, Ascl1은 망막 생성 동안 RPC에서만 발현되지만 성숙한 MG 또는 망막 뉴런9에서는 존재하지 않는다.
생체 내에서 세포를 직접 재프로그래밍하는 것은 방법론적으로 어려울 뿐만 아니라 제도적 동물 관리 및 사용 위원회의 승인이 필요합니다. 승인을 받으려면 사용 또는 변경된 요인, 농도, 오프 타겟 효과, 기본 메커니즘, 독성 및 효율성에 대한 예비 데이터가 필요합니다. 세포 배양 시스템은 생체내 모델에서 사용하기 전에 이러한 기준에 대한 테스트를 허용한다. 더욱이, MG는 전체 망막 세포 집단(10)의 약 5%만을 구성하기 때문에, MG 배양은 이동 12,13, 증식14, 부상/손상에 대한 스트레스 반응 15,16, 미세아교세포 17 또는 망막 신경절 세포(RGCs)18과 같은 다른 세포 유형과의 상호작용을 포함하는 그들의 기능(11)뿐만 아니라 그들의 행동에 대한 연구를 허용한다18, 또는 그들의 신경 인성 잠재력 19,20,21. 많은 연구자들은 무제한의 증식 잠재력을 가지고 있으며 쉽게 유지하고 형질 감염 될 수 있기 때문에 불멸의 세포주를 연구에 사용합니다. 그러나 일차 세포는 진정한 세포 특성 (유전자 및 단백질 발현)을 가지고 있기 때문에 불멸화 된 세포보다 생물학적으로 관련된 분석에 바람직하며, 더 중요한 것은 발달의 특정 단계를 나타내며 따라서 “나이”를 갖기 때문입니다. 동물의 나이 (그리고 결과적으로 동물로부터 얻은 세포의 나이)는 발달22의 진행 단계에 따라 세포 가소성이 감소하기 때문에 세포 재 프로그래밍에서 특히 중요한 요소입니다.
이 프로토콜은 재생성을 연구하기 위한 현재의 시험관내 방법으로서 miRNAs로 일차 MG를 재프로그래밍하는 방법을 상세히 기술한다. 이 MG 일차 배양 모델은 P53 녹아웃 마우스(trp53-/- 마우스)23에서 MG의 세포 증식 특성을 평가하기 위해 2012년에 확립되었다. 배양된 MG가 그들의 아교세포 특징(즉, 면역형광 표지를 통해 평가된 S100β, Pax6 및 Sox2 단백질의 발현)을 유지하고, 생체내 MG(FACS-정제된 MG의 마이크로어레이)23과 유사함을 보여주었다. 그 직후, 아교세포 mRNA 및 단백질 발현을 바이러스 벡터20을 사용하여 다른 접근법에서 검증하고 확인하였다. 몇 년 후, 이들 배양물에서 발견되는 대다수의 세포는 MG 특이적 Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl 리포터 마우스24를 사용하여 MG임을 확인하였다. 더욱이, FACS 정제된 MG 및 배양된 일차 MG 둘 다에서 miRNAs의 세트의 정량화는 MG miRNAs (mGLiomiRs)의 수준이 성장 단계 동안 배양된 MG에서 크게 변하지 않는다는 것을 보여주었다. 그러나 길쭉한 배양 기간은 miRNA가 번역 조절자(25)이기 때문에 miRNA 수준의 변화를 야기하고, 결과적으로 mRNA 수준 및 단백질 발현에 변화를 일으킨다.
2013년에, 이 MG 배양 모델은 MG를 망막 뉴런20으로 재프로그램하는 그들의 능력에 대하여 다양한 전사 인자를 시험하기 위해 사용되었다. Ascl1은 매우 강력하고 신뢰할 수있는 재 프로그래밍 요소로 밝혀졌습니다. 바이러스 벡터를 통한 Ascl1의 과발현은 형태학적 변화, 뉴런 마커의 발현, 및 뉴런 전기생리학적 특성의 획득을 유도하였다. 더욱 중요하게는, 이러한 첫 번째 시험관내 실험으로부터 얻은 통찰력 및 결과가 생체내 응용(in vivo applications)22,26으로 성공적으로 전달되었으며, 이는 일차 MG 배양이 생체내 구현 전에 초기 인자 스크리닝 및 신경교 기능의 평가를 위한 견고하고 신뢰할 수 있는 도구를 나타낸다는 것을 입증한다.
몇 년 전, 망막 뉴런에서도 고도로 발현되는 뇌가 풍부한 miRNA miR-124가 배양된 MG21에서 Ascl1 발현을 유도할 수 있는 것으로 나타났다. 살아있는 세포에서의 Ascl1 발현은 Ascl1 리포터 마우스 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl)를 통해 시각화되었다. 리포터 마우스는 DNA에 리포터 유전자가 삽입된 유전자 조작 마우스입니다. 이 리포터 유전자는 리포터 단백질을 암호화하며, 이는 본 연구에서 적색 형광 단백질인 tdTomato이다. 이러한 리포터 단백질은 관심있는 유전자, 이 경우 Ascl1의 발현을 보고한다. 즉, Ascl1을 발현하는 세포는 빨간색으로 변합니다. Ascl1은 RPC9에서만 발현되기 때문에, 이 Ascl1 CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl 마우스는 MG가 Ascl1 발현 RPC로 전환되는 것을 추적할 수 있게 해주며, 이는 전환 세포가 적색 형광 tdTomato 리포터 단백질을 발현한다는 것을 의미한다. 이것은 이들 세포의 DNA가 변화되기 때문에 돌이킬 수 없는 표지이다. 결과적으로, 임의의 후속 뉴런 분화는 tdTomato 라벨이 분화 세포에 남아 있기 때문에 시각화될 것이다. MG 유래 RPC (tdTomato 라벨 포함)를 발현하는 Ascl1이 뉴런으로 분화되면 이러한 뉴런은 여전히 빨간색 레이블을 갖습니다. 따라서 이 마우스는 라이브 셀 이미징을 위한 MG 유래 RPC의 라벨링을 허용할 뿐만 아니라 이러한 MG 유래(적색) RPC의 운명 매핑 및 계보 추적을 허용합니다. 보다 최근에, RPCs에서 miRNA의 세트가 확인되었고, Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-리포터 마우스의 MG 배양물을 사용하여 이들 miRNA가 리프로그래밍 용량 및 효율27에 미치는 영향을 스크리닝하고 테스트하였다. 하나의 후보물질인 RPC-miRNA miR-25가 배양된 MG를 Ascl1 발현 (Ascl1-Tomato+) 세포로 재프로그래밍할 수 있음을 발견하였다. 이러한 재프로그램된 세포는 뉴런 형태학(작은 소마타 및 짧거나 긴 미세 과정), scRNA-Seq를 통해 측정된 뉴런 전사체의 발현, 면역형광 표지(27)를 통해 검증된 뉴런 단백질의 발현을 포함하여 시간이 지남에 따라 뉴런 특징을 채택한다.
여기서, 프로토콜은 이전 작업 21,24,27로부터 적응된 P12 마우스로부터 MG를 성장 및 형질감염시키는 방법을 상세히 설명한다. 이 프로토콜에 대해 선택된 miRNA는 앞서 언급한 miRNA-25로, MG 또는 망막 뉴런에서 낮은 발현 수준을 갖는 RPC에서 고도로 발현되는 miRNA이다. miR-25를 과발현시키기 위해, 뮤린 miR-25 모방체, 즉 인공 miRNA 분자가 사용된다. 대조군으로서, Caenorhabditis elegans로부터의 miRNA의 모방체가 선택되며, 이는 포유동물 세포에서 아무런 기능도 갖지 않는다. MG를 RPC로 변환하는 시각화는 RPC 리포터 마우스(Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), 배경이 혼합된 마우스(C57BL/6, S129 및 ICR 균주)를 통해 달성되었다. 그러나, 이러한 배양은 야생형 균주를 포함한 모든 마우스 균주와 함께 수행될 수 있다. 지난 몇 년 동안, 원래의 프로토콜은 성장 단계 지속 기간 및 전체 배양 기간을 감소시키고 보다 강력한 아교세포 상태를 보장하고 장기간의 배양 기간에 발생하는 세포 변성의 정도를 최소화하기 위해 수정되었다. 규칙적인 형질감염 시간 창은 또한 3h에서 2일로 연장되었다. 앞서 언급한 바와 같이, 현재의 프로토콜은 MG 배양을 재생 연구를 위한 도구로서 기술하지만, 이 방법은 재프로그래밍 인자를 테스트하는데 유용할 뿐만 아니라, MG 이주 또는 증식성 거동, 손상/세포 손상 관련 패러다임, 및/또는 근본적인 메커니즘 및 경로의 식별에 관한 연구를 포함하는 다른 응용에도 적용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 miRNAs를 이용한 리프로그래밍 연구를 위해 해리된 마우스 망막으로부터 MG를 성장시키는 방법을 기술한다. 다양한 이전 연구에서 보여지고 확인 된 바와 같이, 이들 배양물에서 발견되는 세포의 대다수 (80 % -90 %)는 MG20,23,24입니다. 이 방법은 매우 강력하고 신뢰할 수있는 기술이며 프로토콜을 올바르게 준수하면 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Ann Beaton 박사와 모든 실험실 구성원에게 원고에 대한 의견에 감사드립니다. 시애틀의 워싱턴 대학에서 박사 후 교육 기간 동안 MG 일차 문화를 S.G.W.에 선별 도구로 소개 한 Tom Reh, Julia Pollak 및 Russ Taylor 박사에게 특별한 감사를드립니다. 이 연구는 S.G.W.에 대한 엠파이어 이노베이션 프로그램 (EIP) 그랜트와 SUNY Optometry에서 S.G.W.까지의 스타트업 펀드와 National Eye Institute (NEI)에서 S.G.W.에 이르는 R01EY032532 어워드의 지원을 받았습니다.
Materials
| Animals | |||
| Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
| tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
| Reagents | |||
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
| 16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
| Alexa Fluor 488 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 647 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
| Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
| Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
| Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
| Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
| Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
| Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
| Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 |
frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
| Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
| Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
| Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Rhodamine Red 570 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
| Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
| Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
| plasticware/supplies | |||
| 0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
| 10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
| 100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
| 1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
| 20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
| Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
| PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
| Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 – 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
| Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
| equipment | |||
| 1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
| All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
| Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
| Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
| Dumont #5 Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Dumont #55 Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #7 curved Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
| Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
| Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
| Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
| Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
| Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |
References
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