Hücre Dışı Vezikül Analizi için Donma-Kırık Elektron Mikroskobu

1. Kanserli ürotelyal hücrelerin kültürlenmesi ve EV’lerin izolasyonu NOT: İnsan invaziv mesane kanseri ürotelyal (T24) hücre hattından EV’leri elde etmek için bir protokol sunulmuştur. Bununla birlikte, kültürleme koşullarının diğer hücre tiplerini kullanmak için optimize edilmesi gerekir. Üç şişede 3 × 104 hücre/cm2 yoğunluğa sahip PlakaT24 hücreleri (75cm2’lik büyüyen yüzey) ve hücrelerin 37 ° C’de 3 gün boyunca bir CO 2 inkübatöründe kültürlenmesi ve% 5 CO2 ile başlar (Şekil 2A). T24 hücreleri için% 5 fetal sığır serumu (FBS), 4 mM Glutamax, 100 mg / mL streptomisin ve 100 U / mL penisilin ile desteklenmiş 1: 1 (v / v) A-DMEM ve F12 karışımında bir kültür ortamı kullanın.NOT: Aşağıdaki izolasyon, MV’lerde zenginleştirilmiş EV’ler verir. İzolasyona başlamadan önce, canlılığı ve birleşmeyi doğrulamak için hücreleri bir ışık mikroskobu ile inceleyin (Şekil 2B). T24 hücreleri% 70 birleştiğinde EV’leri şartlandırılmış kültür ortamından toplamaya başlayın. Kültür ortamını MV’lerle şişelerden (T75) bir pipetle konik santrifüj tüplerine toplayın (Şekil 2C). 4 °C’de 10 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj yapın (Şekil 2D). Süpernatantı pipetle birlikte yeni bir santrifüj tüpüne dikkatlice toplayın (Şekil 2E). Süpernatantı 4 ° C’de 20 dakika boyunca 2.000 × g’de santrifüj yapın. Süpernatantı pipetle birlikte dikkatlice yeni bir santrifüj tüpüne toplayın. 4 °C’de 40 dakika boyunca 10.000 × g’da santrifüj. Tüpün dibinde beyazımsı bir pelet olup olmadığına bakın.NOT: Gerekirse, gerekli g-kuvvetine ulaşmak için santrifüj rotorunu değiştirin. EV peleti, santrifüj tüpünün dibinde beyaz bir pelet olarak görülür (Şekil 2F); pipetleme sırasında peleti kaybetmemek için yerini işaretleyin (Şekil 2G). Süpernatantı bir pipetle dikkatlice atın. Pelet’e 1,5 mL PBS ekleyin ve MV’leri içeren peleti yeniden askıya alın. süspansiyonu yeni bir santrifüj tüpüne koyun. 4 ° C’de 40 dakika boyunca 10.000 × g’da santrifüj yapın ve tüpün dibinde beyaz bir pelet olup olmadığına bakın.NOT: EV peleti, santrifüj tüpünün dibinde beyaz bir yama olarak görülür; pipetleme sırasında peleti kaybetmemek için yerini işaretleyin. Süpernatantı bir pipetle dikkatlice atın. Fiksatif,% 2.5 glutaraldehiti 0.1 M sodyum kakodilat tamponuna (pH 7.2) yavaşça ekleyin. 4 °C’de 20 dakika bekletin (Şekil 2H).DİKKAT: Glutaraldehit ve sodyum kakodilat toksiktir. Bir duman başlığında çalışın, koruyucu eldiven giyin ve uygun şekilde atın. Fiksatifi bir pipetle dikkatlice çıkarın. Pelet üzerine yıkama tamponu (0,1 M sodyum kakodilat tamponu) ekleyin. Peleti yeniden askıya almadan 4 ° C’de 10 dakika bekletin. 2. EV’lerin dondurulması NOT: Donmadan önce, önce kriyonumuneleri gliserol ile koruyun. 0.1 M sodyum kakodilat tamponu hazırlayın. Yıkama tamponunu çıkarın ve 0.1 M kakodilat tamponuna 50 μL% 30 gliserol ekleyin. Çözeltiyi homojen hale getirmek için EV’leri nazikçe yeniden askıya alın. 4 °C’de 30 dakika kuluçkaya yatırın. Bakır taşıyıcıları ultrasonik banyoda merkezi bir çukurla kloroform ile 5 dakika boyunca temizleyin (Şekil 3A). Birden fazla numune kullanıyorsanız bunları hava ile kurutun ve renklerle işaretleyin (Şekil 3B). Kullanana kadar, taşıyıcıları kuru ve temiz bir yerde saklayın (örneğin, Petri kabındaki lens kağıdında). Taşıyıcılara çıplak elle dokunmayın. Pipetler, çözeltiler, filtre kağıdı, cımbız, stereomikroskop, freon ve sıvı azotlu (LN2) bir Dewar şişesi, metal bir çubuk ve kriyovyaller hazırlayın. LN2 ile soğutun.DİKKAT: Koruyucu ekipman giyin ve LN2 ve soğutulmuş freon kullanırken buna göre çalışın. Donmadan önce EV’leri tekrar askıya alın. Hava kabarcıkları oluşumundan kaçının.NOT: 2.4-2.7 arasındaki adımları hızla uygulayın. Bir stereomikroskop altında çalışın (Şekil 3C). Numunenin 1.5-1.7 μL’sini bakır taşıyıcının merkezi çukuruna aktarın ve numuneyi kenardan dökmezken bakır taşıyıcı kenarından daha yükseğe ulaşan dışbükey bir damla yapın (Şekil 3D). Aşırı dökülme durumunda, taşıyıcının dış halkasını kurutmak için filtre kağıdı kullanın. Katılaşmış freonu tekrar sıvılaştırmak için metal bir çubukla karıştırın (Şekil 3E). Bakır taşıyıcının dış halkasını cımbızla tutun ve 8 s boyunca cımbızı hafifçe sallayarak soğutulmuş freonun içine daldırın (Şekil 3F). 8 saniye sonra, taşıyıcıyı LN2 ile dolu başka bir Dewar şişesine hızlı bir şekilde aktarın. Numuneleri LN2’de kırmaya veya saklamaya hemen devam edin. İkinci durumda, bir kriyovalı işaretleyin ve şişe ve cımbız uçlarını LN2’ye batırarak soğutun (Şekil 3G). LN 2 altında, dondurulmuş bakır taşıyıcıları şişeye toplayın, kapatın ve donma kırılmasına kadar LN2 kabında (Şekil 3H) saklayın. 3. EV’lerin kırılması ve kopyaların yapılması NOT: Dondurarak kırma ünitesini üreticinin kullanım talimatlarına göre hazırlayın. (Şekil 4A). Ünitenin haznesini temizleyin. Platin (Pt/C) ve karbon (C) tabancalarını sırasıyla 45° ve 90° açılarda konumlandırın (Şekil 4B). Ünite vakum sistemini çalıştırın. 6,6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr) basınca ulaşıldığında, ünite haznesini -150 ° C’ye soğutun. Dondurulmuş numuneli bakır taşıyıcıları kuru cımbız kullanarak dondurarak kırma ünitesine aktarın (Şekil 4C). Numunenin çözülmesini ve buz kristallerinin birikmesini önlemek için kriyotransfer kullanın veya hızlı çalışın. Taşıyıcıları numune tablasına sabitleyin. Vakum tekrar 6,6 × 10−2 Pa’ya (5 × 10−4 Torr) ulaşana kadar bekleyin ve ardından bıçak sıcaklığını -100 ° C’ye ayarlayın (Şekil 4D). Vakum 1,0 × 10−3 Pa’ya (8 × 10−6 Torr) ulaşana kadar bekleyin. Dürbünle numuneyi gözlemleyin ve bıçağa dikkatlice yaklaşın (Şekil 4E). Bıçağın motorlu hareketini (Şekil 4F) ve numunenin yüzeyi pürüzsüz olana kadar kesiti açarak numuneyi kesitlemeye başlayın (Şekil 4G). Kırılma için, bıçağın motorlu hareketini kapatın ve bıçağın yavaş manuel kontrolüne devam edin, böylece numuneyi kırın (Şekil 4H). Kırık yüzeyi gölgelenmeye kadar buz kristalleri ve döküntüler oluşturmaktan korumak için, bıçağı kırık numunenin üzerine getirin. Pt gölgelemesini 45°’de sürdürün (Şekil 4I, J). Bir kronometre hazırlayın ve/veya donma kırma ünitesindeki kuvars kristal monitörü açın, bu da numune üzerindeki Pt kalınlığının denetlenmesini sağlar. Kuvars kristal monitörde ölçülen Pt tabakasının önerilen kalınlığı 2,5 nm’dir, bu da belirli bir yüksek gerilim ve akımda 4 s gölgelemeye karşılık gelir (yani, Pt gölgeleme hızı 0,63 nm / s’dir). Gölgelemeye başlamadan önce, bıçağı numuneden uzağa taşıyın. Pt / C tabancasına (1.600 V) yüksek gerilim uygulayın ve akımı 60 mA’ya yükseltin. Pt kıvılcımları görünmeli ve örneği gölgelemeye başlamalıdır. Bu noktada, 4 s geri sayımı başlatın ve / veya kuvars kristal monitörde Pt konumunu gözlemleyin ve bulun.NOT: C tabakasının önerilen kalınlığı 2,5 nm’dir, bu da belirli bir yüksek gerilim ve akımda 10 s gölgelemeye karşılık gelir. İstenilen Pt kalınlığı elde edildiğinde akımı ve yüksek gerilimi kapatın. C gölgelemesini 90°’de sürdürün (yani, C gölgeleme hızı 0,25 nm/sn’dir). C tabancasına (1.900 V) yüksek gerilim uygulayın, akımı 90 mA’ya yükseltin ve C kıvılcımları görünmeli ve numuneyi gölgelemeye başlamalıdır; o anda, 10 s geri sayımına başlayın. İstenilen C kalınlığı elde edildiğinde akımı ve yüksek gerilimi kapatın. 4. Replikaların temizlenmesi ve replika analizi Numune tablasındaki bakır taşıyıcıları kullanın ve cımbızla porselen 12 delikli bir plakada oda sıcaklığında damıtılmış suya aktarın (Şekil 4K). Kopyalar su yüzeyinde yüzerken, taşıyıcılar batar (Şekil 4L). Kopyaları damıtılmış sudan bir tel halkayla sodyum hipoklorit içeren bir kuyuya aktarın. Bir duman davlumbazında oda sıcaklığında gece boyunca örtün ve bırakın.DİKKAT: Sodyum hipoklorit toksiktir. Bir duman başlığında çalışın, koruyucu eldiven giyin ve uygun şekilde atın. Kopyaları ddH2O’ya aktarın ve 30 dakika boyunca yıkayın. 3 kez tekrarlayın. Kopyaları bir tel döngü ile bir ağ bakır TEM ızgarasına aktarın (örneğin, kare veya petek 100+ ağ). Izgaraları 2 saat boyunca hava ile kurutun ve mikroskopiye kadar ızgara saklama kutusunda saklayın.NOT: Genel olarak, ızgaralar karanlık, kuru, oda sıcaklığı koşullarında aylarca saklanabilir. Kopyaları görüntülemek ve mikrograflar elde etmek için bir TEM mikroskobu kullanın. Bunu yapmak için, bir kopya ile bir TEM ızgarası takın ve üreticinin kullanım kılavuzlarına göre TEM görüntülemeyi başlatın. 80 kV veya 100 kV’ta çalışın. Numuneyi inceleyin ve TEM’deki bir kamera ile daha düşük ve daha yüksek büyütmelerde mikrograflar elde edin. MV’lerin mikrograflarını analiz edin. OG çaplarının ölçümleri için Fiji/ImageJ yazılımı16’yı kullanın. MV’lerin çapı, Hallett ve ark.17’ye göre mikrograflardaki ölçümün 4/π katıdır.