عزل الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة 2 من الغشاء المخاطي للأنف في الفأر للكشف عن تعبير CD226
Summary
تشارك الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة 2 (ILC2s) ، المتورطة في التهاب النوع 2 ، بشكل أساسي في الاستجابة لعدوى الديدان الطفيلية وأمراض الحساسية والتوازن الأيضي وإصلاح الأنسجة. في هذه الدراسة ، تم إثبات إجراء لعزل ILC2s من الغشاء المخاطي للأنف الفئران والكشف عن تعبير CD226.
Abstract
مع الأبحاث الوفيرة حول الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة الثانية (ILC2s) المنشورة على مر السنين ، من المعروف على نطاق واسع أن ILC2s متورطة في تنظيم العمليات المرضية المختلفة ، بما في ذلك المناعة المضادة للديدان الطفيلية ، وإصلاح الأنسجة ، وتوليد الحرارة ، وأمراض المناعة الذاتية مثل الربو والتهاب الأنف التحسسي (AR). تقيم ILC2s بشكل دائم في الأنسجة المحيطية مثل الجلد والأمعاء والرئتين وتجويف الأنف. ومع ذلك ، هناك معلومات محدودة حول وظائفها الدقيقة في مناعة الغشاء المخاطي للأنف. CD226 هو جزيء مكلف منشط ، يتم التعبير عنه بشكل أساسي على الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) والخلايا التائية والخلايا الوحيدة الالتهابية. ومع ذلك ، لا يزال من غير المعروف ما إذا كانت ILC2s تعبر عن CD226 أو تلعب دورا في التسبب في الأمراض المرتبطة ب ILC2s. هنا ، أنشأنا طريقة لعزل وتحديد ILC2s من الغشاء المخاطي للأنف واكتشفنا تعبير CD226 على ILC2s التي تم الحصول عليها من الفئران السليمة و AR. هنا ، نصف هذا البروتوكول لعزل وتحديد ILC2s من الغشاء المخاطي للأنف الفأر ، مما سيساعد في استكشاف الآلية المرضية الداخلية للاضطرابات المناعية في أمراض الغشاء المخاطي للأنف.
Introduction
تم اكتشاف الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة 2 (ILC2s) لأول مرة في أنسجة التجويف البريتوني للفئران وثبت لاحقا وجودها في الدم والأنسجة المحيطية الأخرى مثل الرئتين والجلد وتجويف الأنف1،2،3. كخلايا مقيمة في الأنسجة ، يتم الحفاظ على ILC2s بشكل أساسي وتكاثرها محليا وتعمل كأول حراس يستجيبون للمنبهات الضارة الخارجية من خلال إنتاج العديد من السيتوكينات من النوع 2 وتحفيز المناعة من النوع 24،5،6. يمكن ل ILC2s أيضا ممارسة آثارها عن طريق الاتجار نحو الأنسجة المصابة 7,8.
على غرار خلايا T-helper 2 (Th2) ، تضمن الشبكات التنظيمية المعقدة ل ILC2s مشاركتها الكبيرة في تطور الأمراض الالتهابية المختلفة من النوع الثاني ، بما في ذلك أمراض الحساسية في مجرى الهواء 8,9. في الربو ، يمكن للإنذارات المشتقة من الخلايا الظهارية تنشيط ILC2s ، مما يعزز الالتهاب الرئوي من خلال إفراز إنترلوكين (IL) -4 و IL-5 و IL-1310. أشارت الدراسات السريرية أيضا إلى أن مستويات ILC2 كانت مرتفعة بشكل ملحوظ في البلغم والدم للمرضى الذين يعانون من الربو الحاد ، مما يشير إلى ارتباط ILC2s مع شدة الربو ووظيفتها كمؤشر لتطور الربو11.
التهاب الأنف التحسسي (AR) هو مرض التهابي مزمن شائع يصيب ملايين الأشخاص سنويا ، والعلاجات الفعالة لهذا المرض محدودة12,13. تلعب ILC2s أدوارا حاسمة في الفيزيولوجيا المرضية للواقع المعزز ، سواء في مرحلة التوعية أو توليد الأعراض ومرحلةالالتهاب 14. في المرضى الذين يعانون من AR ، تم الإبلاغ عن ارتفاع مستويات ILC2 في الدم المحيطي محليا وجهازيا15. ومع ذلك ، لا تزال بعض التأثيرات والآليات الأساسية ل ILC2s على الفيزيولوجيا المرضية وتطور AR تتطلب مزيدا من الاستكشاف.
يتم التعبير عن CD226 – وهو بروتين سكري عبر الغشاء يعمل كجزيء مكلف – بشكل أساسي على الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) والخلايا التائية وغيرها من الخلايا الوحيدة الالتهابية16,17. يسمح تفاعل CD226 وروابطه (CD155 و / أو CD112) أو المنافس (TIGIT) بالمشاركة في الوظائف البيولوجية للخلايا المناعية المختلفة18. إن ربط الروابط على الخلايا المقدمة للمستضد ب CD226 على الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا (CTL) يعزز تنشيط كلتا الخليتين في وقت واحد ، في حين يمكن قمع تنشيط CTL بشكل أكبر بواسطة TIGIT (مستقبلات المناعة للخلايا التائية مع مجالات Ig و ITIM) ، منافس CD22619,20. كشفت دراسة بشرية خارج الجسم الحي أن CD226 و CD155 على الخلايا التائية ينظمان التوازن بين Th1 / Th17 و Th2 من خلال التعديل التفاضلي للمجموعات الفرعيةTh 21. يمكن ل CD226 أيضا التوسط في التصاق الصفائح الدموية ونشاط قتل الورم NK22,23. وفي الوقت نفسه ، تمت دراسة CD226 جيدا في التسبب في الأمراض المعدية المختلفة وأمراض المناعة الذاتية والأورام18،24،25. في الوقت الحاضر ، أصبح CD226 نقطة مضيئة جديدة للعلاج المناعي. وقد وجدت الدراسات أن الحويصلات خارج الخلية يمكن أن تعكس تعبير CD226 على الخلايا القاتلة الطبيعية لاستعادة نشاطها السام للخلايا والتدخل في تطور سرطان الرئة26. كشفت دراسة حديثة عن مجموعة فرعية من المجموعة المعوية الجنينية 3 ILCs تتميز بتعبير CD226 عالي عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي أحاديالخلية 27 ، مما يشير إلى أن CD226 قد يمارس أدوارا في المناعة الفطرية بوساطة الخلايا اللمفاوية.
تعتمد معرفتنا حول ILC2s في التهاب مجرى الهواء في المقام الأول على دراسات حول الربو. ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عن وظائفها في مناعة الغشاء المخاطي للأنف. وهكذا ، تم إنشاء بروتوكول لعزل وتحديد ILC2s من الغشاء المخاطي للأنف. تركز الدراسة على التعبير عن CD226 على ILC2s في أنسجة الأنف وتباينه بين الفئران السليمة و AR. قد يوفر هذا رؤى جديدة حول الآليات الأساسية للتنظيم بوساطة ILC2 في المناعة المحلية ويكون بمثابة أساس لتطوير مناهج جديدة لعلاج AR.
Protocol
Representative Results
Discussion
ترتبط ILC2s ارتباطا وثيقا بالتهاب النوع 2 والاضطرابات الالتهابية ، كما يتضح من عدد متزايد من الدراسات. تساهم كل من نماذج الفئران والملاحظة البشرية في فهم أفضل لوظيفتها في مجرى الهواء العلوي. في الفيزيولوجيا المرضية للربو ، يتم تنشيط ILC2s من خلال الليمفوبويتين اللمفاوي اللحمي الصعتري ، IL-25 ، و …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم R.Z. من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81871258) والأموال المقدمة من الجامعة الطبية العسكرية الرابعة (رقم 2020rcfczr). تم دعم YZ من قبل برنامج البحوث الأساسية للعلوم الطبيعية في شنشي (رقم 2021JM-081).
Materials
| Aluminum hydroxide | Meilun biological Technology | 21645-51-2 | |
| CD11b | eBioscience | 11-0112-82 | Used in antibody coctail |
| CD11c | BioLegend | 117306 | Used in antibody coctail |
| CD16/32 | BioLegend | 101302 | Clone: 93; Dilution 1:100 |
| CD226 | BioLegend | 128812 | Used in antibody coctail |
| CD3e | BioLegend | 100306 | Used in antibody coctail |
| CD45 | BioLegend | 103128 | Used in antibody coctail |
| CD45R | eBioscience | 11-0452-82 | Used in antibody coctail |
| CD90.2 | BD Pharmingen | 553014 | Used in antibody coctail |
| Collagenase IV | DIYIBio | DY40128 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | absolute counting beads |
Dnase  |
Beyotime | D7076 | |
| Fetal Bovine Serum | gibco | 10270-106 | |
| Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) | eBioscience | 65-0867-14 | FVD |
| HBSS, calcium, magnesium | Servicebio | G4204-500 | |
| KLRG1 | eBioscience | 17-5893-81 | Used in antibody coctail |
| NaN3 | SIGMA | S2002 | |
| NovoExpress software | AgilentTechnologies | Version 1.5.0 | flow cytometry (FCM) analysis software |
| OVA | SIGMA | 9006-59-1 | |
| PBS, 1x | Servicebio | G4202-500 | |
| PBS, 10x | Servicebio | G4207-500 | |
| Percoll | Yeasen | 40501ES60 | density gradient media |
| RPMI 1640 culture media | Corning | 10-040-CVRV | |
| Spectral cell analyzer | SONY | SA3800 |
References
- Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
- Price, A. E., et al. Systemically dispersed innate IL-13-expressing cells in type 2 immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11489-11494 (2010).
- Ebihara, T., et al. Trained innate lymphoid cells in allergic diseases. Allergology International. 70 (2), 174-180 (2021).
- Gasteiger, G., Fan, X., Dikiy, S., Lee, S. Y., Rudensky, A. Y. Tissue residency of innate lymphoid cells in lymphoid and nonlymphoid organs. Science. 350 (6263), 981-985 (2015).
- Moro, K., et al. Interferon and IL-27 antagonize the function of group 2 innate lymphoid cells and type 2 innate immune responses. Nature Immunology. 17 (1), 76-86 (2016).
- Helou, D. G., et al. LAIR-1 acts as an immune checkpoint on activated ILC2s and regulates the induction of airway hyperreactivity. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 149 (1), 223-236 (2022).
- Karta, M. R., et al. beta2 integrins rather than beta1 integrins mediate Alternaria-induced group 2 innate lymphoid cell trafficking to the lung. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 329-338 (2018).
- Helou, D. G., et al. PD-1 pathway regulates ILC2 metabolism and PD-1 agonist treatment ameliorates airway hyperreactivity. Nature Communications. 11 (1), 3998 (2020).
- Kabata, H., Moro, K., Koyasu, S. The group 2 innate lymphoid cell (ILC2) regulatory network and its underlying mechanisms. Immunological Reviews. 286 (1), 37-52 (2018).
- Zheng, H., et al. The role of Type 2 innate lymphoid cells in allergic diseases. Frontiers in Immunology. 12, 586078 (2021).
- Maggi, L., et al. The dual function of ILC2: From host protection to pathogenic players in type 2 asthma. Molecular Aspects of Medicine. 80, 100981 (2021).
- Meltzer, E. O., et al. Burden of allergic rhinitis: results from the Pediatric Allergies in America survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 124, 43-70 (2009).
- Wheatley, L. M., Togias, A. Clinical practice. Allergic rhinitis. The New England Journal of Medicine. 372 (5), 456-463 (2015).
- Bousquet, J., et al. Allergic rhinitis. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 95 (2020).
- Kato, A. Group 2 innate lymphoid cells in airway diseases. Chest. 156 (1), 141-149 (2019).
- Nakamura-Shinya, Y., et al. DNAM-1 promotes inflammation-driven tumor development via enhancing IFN-gamma production. International Immunology. 34 (3), 149-157 (2022).
- Braun, M., et al. CD155 on Tumor cells drives resistance to immunotherapy by inducing the degradation of the activating receptor CD226 in CD8(+) T cells. Immunity. 53 (4), 805-823 (2020).
- Huang, Z., Qi, G., Miller, J. S., Zheng, S. G. CD226: An emerging role in immunologic diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 564 (2020).
- Gilfillan, S., et al. DNAM-1 promotes activation of cytotoxic lymphocytes by nonprofessional antigen-presenting cells and tumors. Journal of Experimental Medicine. 205 (13), 2965-2973 (2008).
- Zhang, D., et al. TIGIT-Fc alleviates acute graft-versus-host disease by suppressing CTL activation via promoting the generation of immunoregulatory dendritic cells. Biochimica et Biophysica Acta: Molecular Basis of Disease. 1864, 3085-3098 (2018).
- Lozano, E., Joller, N., Cao, Y., Kuchroo, V. K., Hafler, D. A. The CD226/CD155 interaction regulates the proinflammatory (Th1/Th17)/anti-inflammatory (Th2) balance in humans. Journal of Immunology. 191 (7), 3673-3680 (2013).
- Kojima, H., et al. CD226 mediates platelet and megakaryocytic cell adhesion to vascular endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (38), 36748-36753 (2003).
- Martinet, L., Smyth, M. J. Balancing natural killer cell activation through paired receptors. Nature Reviews. Immunology. 15 (4), 243-254 (2015).
- Yeo, J., Ko, M., Lee, D. H., Park, Y., Jin, H. S. TIGIT/CD226 axis regulates anti-tumor immunity. Pharmaceuticals. 14 (3), 200 (2021).
- Nakano, M., et al. Association of elevated serum soluble CD226 levels with the disease activity and flares of systemic lupus erythematosus. Scientific Reports. 11 (1), 16162 (2021).
- Chang, W. A., et al. miR-150-5p-containing extracellular vesicles are a new immunoregulator that favor the progression of lung cancer in hypoxic microenvironments by altering the phenotype of NK cells. Cancers. 13 (24), 6552 (2021).
- Stehle, C., et al. T-bet and RORalpha control lymph node formation by regulating embryonic innate lymphoid cell differentiation. Nature Immunology. 22 (10), 1231-1244 (2021).
- Piao, C. H., Fan, Y. J., Nguyen, T. V., Song, C. H., Chai, O. H. Mangiferin alleviates ovalbumin-induced allergic rhinitis via Nrf2/HO-1/NF-kappaB signaling pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3415 (2020).
- Zhao, Y., Tao, Q., Wu, J., Liu, H. DMBT1 has a protective effect on allergic rhinitis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 121, 109675 (2020).
- Piao, C. H., et al. Ethanol extract of Dryopteris crassirhizoma alleviates allergic inflammation via inhibition of Th2 response and mast cell activation in a murine model of allergic rhinitis. Journal of Ethnopharmacology. 232, 21-29 (2019).
- Liang, M. J., et al. Immune responses to different patterns of exposure to ovalbumin in a mouse model of allergic rhinitis. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 273 (11), 3783-3788 (2016).
- Ebbo, M., Crinier, A., Vely, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews. Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
- Seehus, C. R., et al. Alternative activation generates IL-10 producing type 2 innate lymphoid cells. Nature Communications. 8 (1), 1900 (2017).
- Cai, T., et al. IL-17-producing ST2(+) group 2 innate lymphoid cells play a pathogenic role in lung inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (1), 229-244 (2019).
- Golebski, K., et al. IL-1beta, IL-23, and TGF-beta drive plasticity of human ILC2s towards IL-17-producing ILCs in nasal inflammation. Nature Communications. 10 (1), 2162 (2019).
- Lei, A., Zhou, J. Cell-surface molecule-mediated cell-cell interactions in the regulation of ILC2-driven allergic inflammation. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (22), 4503-4510 (2019).
- Maazi, H., et al. ICOS:ICOS-ligand interaction is required for type 2 innate lymphoid cell function, homeostasis, and induction of airway hyperreactivity. Immunity. 42 (3), 538-551 (2015).
- Lei, A. H., et al. ICAM-1 controls development and function of ILC2. The Journal of Experimental Medicine. 215 (8), 2157-2174 (2018).
- Drake, L. Y., Iijima, K., Kita, H. Group 2 innate lymphoid cells and CD4+ T cells cooperate to mediate type 2 immune response in mice. Allergy. 69 (10), 1300-1307 (2014).
- Wang, Y., et al. The comparation of intraperitoneal injection and nasal-only delivery allergic rhinitis model challenged with different allergen concentration. American Journal of Rhinology & Allergy. 33 (2), 145-152 (2019).
- Niu, Y., et al. HIF1alpha deficiency in dendritic cells attenuates symptoms and inflammatory indicators of allergic rhinitis in a SIRT1-dependent manner. International Archives of Allergy and Immunology. 181 (8), 585-593 (2020).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of alpha-lipoic acid via balancing Th17/Treg expression and enhancing Nrf2/HO-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Pyun, B. J., et al. Gardenia jasminoides attenuates allergic rhinitis-induced inflammation by inhibiting periostin production. Pharmaceuticals (Basel). 14 (10), 986 (2021).
- Liu, Z., et al. Analysis of expression of ILC2 cells in nasal mucosa based on animal model of allergic bacterial infection rhinitis. Journal of Infection and Public Health. 14 (1), 77-83 (2021).
- Hu, B., Wang, Y., Zheng, G., Zhang, H., Ni, L. Effect of parasympathetic inhibition on expression of ILC2 cells in a mouse model of allergic rhinitis. The World Allergy Organization journal. 14 (9), 100582 (2021).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Krisna, S. S., et al. Optimized protocol for immunophenotyping of melanoma and tumor-bearing skin from mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100627 (2021).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential ‘inflammatory’ type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
- Loering, S., et al. Differences in pulmonary group 2 innate lymphoid cells are dependent on mouse age, sex and strain. Immunology and Cell Biology. 99 (5), 542-551 (2021).
- Lin, L., et al. Allergic inflammation is exacerbated by allergen-induced type 2 innate lymphoid cells in a murine model of allergic rhinitis. Rhinology Journal. 55 (4), 339-347 (2017).
