Cellodlingstekniker har gett upphov till många framsteg inom olika områden av cellulär neurofysiologi inom hälsa och sjukdom. Särskilt primära cellkulturer, nyligen isolerade från neuronvävnaden hos ett laboratoriedjur, tillåter experimentören att noggrant studera beteendet hos olika celler i olika biokemiska medier och fysiologiska inställningar. Att använda olika fluorescerande fysiologiska indikatorer som Ca²⁺-känsliga färgämnen i kombination med time-lapse-videomikroskopi ger bättre inblick i de cellulära biofysiska och biokemiska processerna i realtid.

ALS är en förödande neurodegenerativ sjukdom som drabbar övre och nedre motorneuroner¹. Sjukdomen har en komplex patogenes av familjär typ men mestadels av sporadisk form (90% av fallen)². Det är välkänt att icke-cellautonoma mekanismer bidrar till ALS-patofysiologi, främst på grund av glialcellernas väsentliga roll³. ALS karakteriseras också väl som en neuroinflammatorisk sjukdom med involvering av humorala och cellulära faktorer av inflammation.

Immunoglobulin G används ofta som en molekylär markör vid ALS och andra neurodegenerativa sjukdomar. Att studera serumnivån för denna markör kan indikera närvaron och stadiet av neuroinflammation i sjukdomen ^4,5,6, medan dess närvaro i cerebrospinalvätskan kan indikera ett brott mot blodhjärnbarriären⁷. IgG identifierades också som avlagringar i ryggmärgsmotorneuronerna hos ALS-patienter⁷. Ändå har detta tillvägagångssätt visat vissa inkonsekvenser i korrelationen mellan nivån av IgG och sjukdomsstadiet och egenskaperna hos sjukdomen⁶.

IgG isolerad från serum hos ALS-patienter (ALS IgG) kan inducera ett kalciumsvar i naiva astrocyter⁸ och glutamatfrisättning i nervceller, vilket pekar på en excitotoxisk effekt – ett kännetecken för ALS-patologi⁹. Studier på hSOD1^G93A ALS-råttmodellen (innehållande flera kopior av den humana SOD1-mutationen¹⁰) visade dock ett antal markörer för oxidativ stress i odlade neurogliaceller¹¹, vävnader 12,13,14 eller levande djur ¹³. Det är anmärkningsvärt att astrocyterna som odlades från ALS-råttmodellen var mer benägna att oxidativ stress inducerad av peroxid än astroglia från icke-transgena kullkamrater¹¹.

Mikrogliaceller i odling påverkas av ALS IgG på ett mindre uppenbart sätt. En BV-2 mikroglial cellinje visade nämligen en ökning av signalen från fluorescerande markörer för oxidativ stress som svar på appliceringen av endast 4/11 ALS IgG-patientprover¹⁵. Det är välkänt att mikroglia deltar i många neuroinflammatoriska patologier, vilket bidrar till oxidativ stress och sen progressionsfas i den icke-cellautonoma mekanismen för ALS^16,17. Ändå indikerade data med ALS IgGs att dessa celler kanske inte är lika reaktiva som astrocyter mot dessa humorala faktorer av ALS-inflammation. Flera studier har utförts med primära astrocyter från ALS murinmodeller, inte bara hos ungar utan också hos symtomatiska djur, antingen på hjärnan eller på ryggmärgen 18,19,20,21. Detta gäller även för mikrogliala primära kulturer, men i mindre utsträckning än astrocyter och mestadels från hjärnregioner i embryonalstadiet^22,23,24.

Vi använder time-lapse videoavbildning av Ca²⁺ på celler i odling främst som ett sätt att följa intracellulära transienter av denna jon som en fysiologisk markör för excitotoxicitet. Genom biofysisk karakterisering av dessa transienter (amplitud, område under övergående, stigtid, frekvens) kan forskaren således erhålla experimentella diagnostiska parametrar från olika cellulära modeller av neurodegeneration. Denna teknik erbjuder således en fördel av en kvantitativ fysiologisk bedömning av IgG som sjukdomsbiomarkörer. Det finns en stor mängd litteratur om IgGs och Ca²⁺ roll i induktionen av ALS. De flesta av dessa studier utfördes genom att inducera ALS genom att injicera patientens IgG i försöksdjur 25,26,27,28,29^, som sedan visade intracellulär Ca ²⁺ förhöjning och IgG-deposition. En rad studier undersökte effekten av ALS IgG på motorsynapsen in vitro^30,31,32. I ovanstående sammanhang sätter tekniken som presenteras här fokus på gliacellerna som viktiga aktörer i den icke-cellautonoma mekanismen för ALS och kvantifierar deras potentiella excitotoxiska svar på IgG som humorala faktorer för neuroinflammation. Detta tillvägagångssätt kan ha en bredare tillämpning vid testning av andra humorala faktorer som hela sera, CSF eller cytokiner i olika cellodlingssystem och i cellulära modeller av allmän inflammation.

Detta dokument beskriver hur man förbereder primära kulturer av gliaceller, astrocyter och mikroglia från kortikerna hos Sprague Dawley-råttor och hur man ytterligare använder dessa celler för att studera ALS-patofysiologi med patientens sera-härledda IgG. Protokollen är detaljerade för färgämnesbelastning av odlade celler (figur 1) och inspelningar av Ca²⁺ förändringar i time-lapse videoavbildningsexperiment. Exempel på videoinspelningar visar hur gliaceller reagerar på ALS IgG jämfört med ATP, det senare aktiverar purinerga membranreceptorer. För första gången visas ett exempel på hur astrocyter isolerade från hSOD1^G93A ALS-råtthjärnan reagerar med ett mer uttalat Ca 2+ svar på ALS IgG jämfört med icke-transgena kontroller och hur man relaterar denna process till skillnaderna i Ca²⁺ butiksdrift. Dessutom visas ett exempel på kalciumavbildning i mikrogliaceller som akut utmanas med ALS IgG, med endast ett blygsamt svar av intracellulärt kalcium.