Summary

Herbruikbare eencellige cel voor iteratieve epigenomische analyses

Published: February 11, 2022
doi:

Summary

Het huidige protocol beschrijft een eencellige methode voor iteratieve epigenomische analyses met behulp van een herbruikbare enkele cel. De herbruikbare enkele cel maakt analyses van meerdere epigenetische markeringen in dezelfde enkele cel en statistische validatie van de resultaten mogelijk.

Abstract

De huidige eencellige epigenoomanalyses zijn ontworpen voor eenmalig gebruik. De cel wordt na eenmalig gebruik weggegooid, waardoor analyse van meerdere epigenetische markeringen in een enkele cel wordt voorkomen en gegevens van andere cellen nodig zijn om signaal van experimentele achtergrondruis in een enkele cel te onderscheiden. Dit artikel beschrijft een methode om dezelfde enkele cel te hergebruiken voor iteratieve epigenomische analyses.

Bij deze experimentele methode worden cellulaire eiwitten eerst verankerd aan een polyacrylamidepolymeer in plaats van ze te koppelen aan eiwit en DNA, waardoor structurele vertekening wordt verlicht. Deze kritische stap maakt herhaalde experimenten met dezelfde enkele cel mogelijk. Vervolgens wordt een willekeurige primer met een steigersequentie voor nabijheidsligatie gegloeid aan het genomische DNA en wordt de genomische sequentie bij uitbreiding aan de primer toegevoegd met behulp van een DNA-polymerase. Vervolgens worden een antilichaam tegen een epigenetische marker en controle IgG, elk gelabeld met verschillende DNA-sondes, gebonden aan de respectieve doelen in dezelfde enkele cel.

Nabijheidsligatie wordt geïnduceerd tussen de willekeurige primer en het antilichaam door een connector-DNA toe te voegen met complementaire sequenties aan de scaffold-sequentie van de willekeurige primer en de antilichaam-DNA-sonde. Deze aanpak integreert antilichaaminformatie en nabijgelegen genoomsequenties in een enkel DNA-product van nabijheidsligatie. Door herhaalde experimenten met dezelfde enkele cel mogelijk te maken, maakt deze methode een toename van de gegevensdichtheid van een zeldzame cel en statistische analyse mogelijk met alleen IgG- en antilichaamgegevens van dezelfde cel. De herbruikbare afzonderlijke cellen die met deze methode zijn bereid, kunnen minstens een paar maanden worden bewaard en later worden hergebruikt om de epigenetische karakterisering te verbreden en de gegevensdichtheid te verhogen. Deze methode biedt flexibiliteit aan onderzoekers en hun projecten.

Introduction

Single-cell technologie betreedt het tijdperk van single-cell multiomics, dat individuele single-cell omics-technologieën integreert1. Onlangs is single-cell transcriptomics gecombineerd met methoden voor het detecteren van chromatinetoegankelijkheid (scNMT-seq2 en SHARE-seq3) of histonmodificaties (Paired-seq4 en Paired-Tag5). Meer recent werden single-cell transcriptomics en proteomics geïntegreerd met chromatine toegankelijkheid (DOGMA-seq6). Deze methoden maken gebruik van transposase-gebaseerde tagging voor het detecteren van chromatinetoegankelijkheid of histonmodificaties.

Transposase-gebaseerde benaderingen splitsen genomisch DNA en voegen een DNA-streepjescode toe aan het einde van het genomische DNA-fragment. Elk gespleten genomisch fragment kan slechts maximaal twee DNA-barcodes accepteren (= één epigenetisch merkteken per splitsingsplaats), en het genomische DNA op de splitsingsplaats gaat verloren. Daarom hebben op splitsing gebaseerde benaderingen een afweging tussen het aantal geteste epigenetische markeringen en de signaaldichtheid. Dit belemmert de analyse van meerdere epigenetische markeringen in dezelfde enkele cel. Een eencellige epigenomische methode die het genomische DNA niet splitst, werd ontwikkeld om dit probleem op te lossen 7,8.

Naast het hierboven genoemde splitsingsprobleem, hebben op transposase gebaseerde benaderingen nog andere beperkingen. Bij eencellige epigenoomanalyse is het van cruciaal belang om de locatie van histonen en DNA-geassocieerde eiwitten op het genoom te kennen. In de huidige benaderingen wordt dit bereikt door gebruik te maken van niet-gefixeerde afzonderlijke cellen en het behoud van eiwit-DNA en eiwit-eiwitinteracties. Dit genereert echter een sterke bias voor toegankelijke chromatinegebieden, zelfs bij de analyse van histonmodificaties 9. De locatie van histonen en genoom-geassocieerde eiwitten op het genoom kan worden bewaard zonder eiwit-DNA en eiwit-eiwit te vermengen, met behulp van een polyacrylamide scaffold 7,8. Deze benadering vermindert de structurele vertekening die wordt waargenomen in de huidige benaderingen die afhankelijk zijn van eiwit-DNA en eiwit-eiwitinteracties.

Transposase-gebaseerde benaderingen kunnen slechts één keer signalen van een enkele cel ontvangen. Daarom is het moeilijk om het volledige epigenoom van een enkele cel af te bakenen vanwege het wegvallen van de signalen. Herbruikbare afzonderlijke cellen zijn ontwikkeld om de huidige beperkingen te overwinnen door iteratieve epigenomische analyse in dezelfde enkele cel mogelijk te maken.

Protocol

OPMERKING: Een schematische weergave van de methode is weergegeven in figuur 1. Figuur 1: Schematische weergave van de protocolworkflow. Stappen 7.2-13 worden uitgelegd aan de hand van schematische weergaven. Elke rij geeft een stap in het protocol aan. Een cellulair eiwit dat groen gekleurd is, is e…

Representative Results

K562 enkele cellen werden gegenereerd met behulp van het protocol beschreven in stap 8 (zie figuur 5). Enkele cellen waren ingebed in de buitenste laag van de polyacrylamidekraal. Cel-DNA werd gekleurd en gevisualiseerd met behulp van een intercalatorkleurstof voor DNA-kleuring. Figuur 5: Gegenereerde herbruikb…

Discussion

Dit artikel beschrijft het stapsgewijze protocol voor de onlangs gerapporteerde eencellige multi-epigenomische analyse met herbruikbare afzonderlijke cellen7. In de volgende paragrafen bespreken we kritieke punten, waarbij we de nadruk leggen op mogelijke beperkingen in het protocol.

Een van de kritieke punten in het protocol (van stap 7.2-13) is het vermijden van DNase-besmetting. Een enkele cel heeft slechts twee kopieën van genomisch DNA. Daarom vermindert het besc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We bedanken Drs. David Sanchez-Martin en Christopher B. Buck voor hun commentaar tijdens de conceptualiseringsfase van het project. We bedanken ook de Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health voor hulp bij voorbereidende experimenten en de Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH voor advies in computationele analyse. We bedanken mevrouw Anna Word voor het helpen met de optimalisatie van DNA-polymerasen die in de methode worden gebruikt. Dit werk maakte gebruik van de computationele middelen van het NIHHPC Biowulf-cluster (http://hpc.nih.gov). Dit project wordt ondersteund door het intramurale programma van het Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, de NCI Director’s Innovation Award (# 397172) en federale fondsen van het National Cancer Institute onder contractnummer HHSN261200800001E. We bedanken Drs. Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy en alle leden van het Laboratorium voor Cellulaire Oncologie voor productieve opmerkingen.

Materials

10x CutSmart buffer New England BioLabs B6004 10x Digestion buffer
200 proof ethanol Warner-Graham Company 200 proof Ethanol
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] Epigentek A-1018-100 Anti-5hmC
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain Logos Biosystems F23001 Cell counter
Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology MilliporeSigma 01697-500ML 40% acrylamide solution
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 Keyence BZ-X710 Scanning microscope
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit MilliporeSigma UFC510024 Ultrafiltration cassette
Ammonium persulfate for molecular biology MilliporeSigma A3678-100G Ammonium persulfate powder
Anhydrous DMF Vector laboratories S-4001-005 Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF)
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] Abcam ab5408 Anti-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody Abcam ab60950 Anti-Med1
BciVI New England BioLabs R0596L BciVI
Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology MilliporeSigma B8667-5ML 20% BSA (Table 7)
Bst DNA Polymerase, Large Fragment New England BioLabs M0275L Bst DNA polymerase
BT10 Series 10 µl Barrier Tip NEPTUNE BT10 P10 low-retention tip
CellCelector Automated Lab Solutions N/A Automated single cell picking robot
CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA Automated Lab Solutions CC0079 4 nL nanowell plate
Chloroform MilliporeSigma Chloroform
Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate Corning 3596 Flat-bottom 96-well plates
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase New England BioLabs M0259L Exo DNA polymerase
DNA LoBind Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30108035 0.5 mL DNA low-binding tube
DNA Oligo, 1st random primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 1st random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd synthesis primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd synthesis primer
DNA Oligo, Ligation Adaptor Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Ligation Adaptor
DNA Oligo, Reverse Transcription primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Reverse Transcription primer
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303L DNase I (RNase-free, 4 U).
DNase I Reaction Buffer New England BioLabs B0303S 10x DNase I buffer (NEB)
dNTP Mix (10 mM each) Thermo Fisher R0192 10 mM dNTPs
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated MilliporeSigma F4135-500ML Fetal bovine serum
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs E2040S In-vitro-transcription master mix
Histone H3K27ac antibody Active motif 39133 Anti-H3K27ac
Histone H3K27me3 antibody Active motif 39155 Anti-H3K27me3
IgG from rabbit serum Millipore Sigma I5006-10MG Control IgG
Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized MilliporeSigma 747467-1G NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder
K-562 American Type Culture Collection (ATCC) CCL-243 cells
Linear Acrylamide (5 mg/mL) Thermo Fisher AM9520 Linear Acrylamide
LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter Logos Biosystems L20001 Cell counter
LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides Logos Biosystems L12001 Cell counter
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil MilliporeSigma M5904-500ML Mineral oil
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology MilliporeSigma T7024-100ML N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine
NaCl (5 M), RNase-free Thermo Fisher AM9760G 5M NaCl
NanoDrop Lite Thermo Fisher 2516  Microvolume spectrophotometer
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom Opentrons N/A 2 mL deep well 96-well plate
Non-skirted 96-well PCR plate Genesee Scientific 27-405 96-well PCR plate
NuSive GTG Agarose Lonza 50081 Agarose
OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution MilliporeSigma 1300-500ML 40%Acrylamide/Bis-acrylamide
OT-2 lab robot Opentrons OT2 Automated liquid handling robot
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15713 20% Pararmaldehyde
PBS (10x), pH 7.4 Thermo Fisher 70011044 10x PBS
PIPETMAN Classic P1000 GILSON F123602 A P1000 pipette
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 925000090 1.5 mL Protein low-binding tube
QIAgen Gel Extraction kit Qiagen 28706 A P1000 pipette
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Thermo Fisher P11495  dsDNA specific intercalator dye
Quick Ligation kit New England BioLabs M2200L T4 DNA ligase (NEB)
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher 10777019 RNAse inhibitor
S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) Vector laboratories S-1004-105 Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB)
S-HyNic Vector laboratories S-1002-105 Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic)
Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade MilliporeSigma 567422-100ML 3M Sodium acetate (pH 5.2)
Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 Alfa Aesar J60408 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5
Sodium phosphate dibasic for molecular biology MilliporeSigma S3264-250G Na2HPO4
Sodium phosphate monobasic for molecular biology MilliporeSigma S3139-250G NaH2PO4
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher 18090050 Reverse transcriptase
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) Thermo Fisher S11494 An intercalator dye for DNA
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England BioLabs B0202S 10x T4 DNA ligase reaction buffer
ThermoPol Reaction Buffer Pack New England BioLabs B9004S 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100)
TRIzol LS reagent Thermo Fisher 10296-028 Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction
TruSeq Nano DNA library prep kit Illumina 20015965 A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for control IgG
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020 0.5M EDTA, pH 8.0
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher 10977023 Ultrapure water
Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher 89882 Desalting column

References

  1. Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
  2. Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781 (2018).
  3. Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
  4. Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
  5. Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
  6. Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
  7. Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
  8. Tosato, G., Ohnuki, H. . Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , (2021).
  9. Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
  10. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  11. Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
  12. Weast, R. C., Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H., et al. . Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. , (1975).
  13. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  14. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12 (2013).
  15. Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
  16. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
  17. Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696 (2018).
  18. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  19. Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
  20. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).

Play Video

Cite This Article
Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses. J. Vis. Exp. (180), e63456, doi:10.3791/63456 (2022).

View Video