Förster Resonance Energy Transfer Mapping: una nuova metodologia per chiarire le caratteristiche strutturali globali

Per le proteine, la delucidazione della dinamica insieme alla conoscenza strutturale tridimensionale (3-D) porta a una migliore comprensione delle relazioni struttura-funzione dei sistemi biomolecolari. I metodi strutturali, come la cristallografia a raggi X e la microscopia elettronica criogenica, catturano una struttura statica e spesso richiedono la determinazione di più strutture per chiarire gli aspetti del legame e della dinamica delle biomolecole¹. In questo articolo viene descritto un metodo basato su soluzione per la mappatura di elementi strutturali globali, ad esempio siti di associazione o interazioni di associazione, potenzialmente più transitori e meno facilmente acquisibili con metodi statici. I sistemi candidati forti per questa metodologia sono quelli in cui una struttura 3D è stata precedentemente determinata mediante cristallografia a raggi X, spettroscopia NMR o altri metodi strutturali. In questo caso, sfruttiamo la struttura cristallina a raggi X del complesso SecA-SecYEG, un attore centrale nella via secretoria generale della proteina, per mappare la posizione di un sito di legame peptidico del segnale utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) prima del trasporto della preproteina attraverso la membrana². La manipolazione del sistema biologico attraverso modificazioni genetiche unita alla nostra conoscenza della struttura 3D ha permesso la determinazione della conformazione della sequenza del segnale e della regione precoce matura immediatamente prima dell’inserimento nel canale ³.

FRET comporta il trasferimento di energia senza radiazioni da una molecola (donatore) a un’altra (accettore) in modo dipendente dalla distanza che è attraverso lo spazio ^4,5. L’efficienza di questo trasferimento viene monitorata attraverso una diminuzione del donatore o un aumento dell’intensità di fluorescenza dell’accettore. L’efficienza del trasferimento di energia può essere descritta come

E = R₀⁶/(R₀⁶ + R⁶)

in cui il valore R₀ è la distanza alla quale il trasferimento è efficiente al 50%⁶. La tecnica è stata precedentemente descritta come un righello molecolare ed è efficace nel determinare distanze nell’intervallo 2,5-12 nm, a seconda dell’identità dei coloranti donatore-accettore 4,7,8,9. Le intensità di fluorescenza del donatore e la durata di vita con o senza accettore consentono di determinare le efficienze di trasferimento e, di conseguenza, le distanze ^5,8. A causa della disponibilità della tecnologia, della sensibilità del metodo e della facilità d’uso, FRET ha anche trovato ampia applicazione in settori come la spettroscopia di fluorescenza a singola molecola e la microscopia confocale⁶. L’avvento di proteine fluorescenti come la proteina fluorescente verde ha reso l’osservazione della dinamica intracellulare e l’imaging delle cellule vive relativamente facile^10,11. Molte applicazioni FRET come queste sono discusse in dettaglio in questo numero virtuale.

In questo studio, ci concentriamo in particolare sull’uso delle misurazioni FRET per produrre valori di distanza per determinare i dettagli strutturali. In precedenza, le misurazioni FRET sono state efficacemente utilizzate per determinare la conformazione delle molecole di DNA quando legate alla proteina ^12,13,14, la dinamica interna delle proteine e le interazioni di legame proteico 15,16,17. I vantaggi di questo metodo risiedono nella capacità di determinare elementi strutturali flessibili e dinamici in una soluzione con quantità relativamente basse di materiale. Significativamente, questo metodo è particolarmente efficace se utilizzato in combinazione con le informazioni strutturali esistenti e non può essere utilizzato come mezzo di determinazione della struttura 3D. Il metodo fornisce la migliore comprensione e perfezionamento della struttura se il lavoro si basa su informazioni strutturali esistenti spesso accoppiate con la simulazione computazionale^18,19. Qui, l’uso di distanze ottenute da misure FRET allo stato stazionario e risolte nel tempo è descritto per mappare un sito di legame, la cui posizione non era nota, su una struttura cristallografica esistente del complesso SecA-SecYEG, le principali proteine nella via secretoria generale³.

La via secretoria generale, un sistema altamente conservato dai procarioti agli eucarioti agli archaea, media il trasporto delle proteine attraverso o nella membrana fino alla loro posizione funzionale nella cellula. Per i batteri Gram-negativi, come E. coli, l’organismo utilizzato nel nostro studio, le proteine vengono inserite o traslocate attraverso la membrana interna al periplasma. Il complesso di canali SecY batterici (chiamato translocon) si coordina con altre proteine per traslocare la proteina appena sintetizzata, che viene diretta alla sua posizione corretta nella cellula attraverso una sequenza di segnali tipicamente situata al N-terminus^20,21. Per le proteine legate al periplasma, la proteina ATPasi SecA si associa al tunnel di uscita del ribosoma e alla preproteina dopo che circa 100 residui sono stati tradotti²². Insieme alla proteina chaperone SecB, mantiene la preproteina in uno stato spiegato. SecA si lega al translocon SecYEG e, attraverso molti cicli di idrolisi dell’ATP, facilita il trasporto delle proteine attraverso la membrana^23,24.

SecA è una proteina multi-dominio che esiste in forme citosoliche e legate alla membrana. Una proteina omodimerica nel citosol, SecA è costituita da un dominio di legame preproteico o cross-linking²⁵, due domini leganti nucleotidi, un dominio alare elicoidale, un dominio elicoidale scaffold e il dito a due eliche (THF) 26,27,28,29 (Figura 1). In precedenti studi cristallografici del complesso SecA-SecYEG, la posizione del THF suggeriva che fosse attivamente coinvolto nella traslocazione delle proteine e nei successivi esperimenti di cross-linking con il peptide segnale ha ulteriormente stabilito il significato di questa regione nella traslocazione proteica^30,31. Studi precedenti, utilizzando la metodologia di mappatura FRET, hanno dimostrato che i peptidi di segnale esogeni si legano a questa regione di SecA ^2,32. Per comprendere appieno la conformazione e la posizione della sequenza del segnale e della regione precoce matura della preproteina prima dell’inserimento nel canale SecYEG, è stata creata una chimera proteica in cui la sequenza del segnale e i residui della regione della prima maturità sono stati attaccati alla SecA attraverso un linker Ser-Gly (Figura 1). Usando questo costrutto biologicamente vitale, è stato ulteriormente dimostrato che la sequenza del segnale e la regione precoce matura della preproteina si legano al THF in modo parallelo². Successivamente, la metodologia di mappatura FRET è stata utilizzata per chiarire la conformazione e la posizione della sequenza del segnale e della regione di maturazione precoce in presenza di SecYEG come descritto di seguito³.

La conoscenza della struttura 3D del complesso SecA-SecYEG ^33,34,35 e la possibile posizione del sito di legame ci hanno permesso di posizionare giudiziosamente le etichette donatore-accettore in luoghi in cui l’intersezione delle singole distanze FRET identifica la posizione del sito di legame. Queste misurazioni della mappatura FRET hanno rivelato che la sequenza del segnale e la regione precoce matura della preproteina formano una forcina con la punta situata alla bocca del canale SecYEG, dimostrando che la struttura della forcina è modellata prima dell’inserimento del canale.