JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
면역학 및 감염병학

Açık Kaynak Pipetleme Robotlarını Kullanan Verimli SARS-CoV-2 Kantitatif Ters Transkriptaz PCR Tükürük Teşhis Stratejisi

Published: February 11, 2022
doi:
10.3791/63395
, , , , , , ,
1Center for Innovative Medical Devices and Sensors (REDDI Lab),Clemson University, 2Department of Bioengineering,Clemson University, 3Swann Medicine, 4Student Health Services,Clemson University, 5Department of Chemical & Biomolecular Engineering,Clemson University, 6Department of Chemical & Biomolecular Engineering,University of Delaware

Summary

Protokol, tükürük örneklerinin RT-qPCR moleküler testini gerçekleştirmek için açık kaynaklı otomasyon kullanan bir SARS-CoV-2 tanı yöntemini açıklamaktadır. Bu ölçeklenebilir yaklaşım, klinik halk sağlığı gözetimine ve daha küçük üniversite laboratuvarlarının kapasitesini artırmaya uygulanabilir.

Abstract

Son SARS-CoV-2 küresel sağlık krizinin ortaya çıkışı, epidemiyolojik araştırmalar ve klinik testler için önemli zorluklar getirmiştir. Yüksek bulaşma oranı ve düşük mortalite ile karakterize edilen COVID-19 pandemisi, özellikle konut üniversiteleri gibi kapalı popülasyonlarda doğru ve etkili tanı testleri gerektirmiştir. Nazofarengeal sürüntüler gibi nükleik asit testlerinin ilk kullanılabilirliği, test sonuçlarının raporlanmasını da geciktiren tedarik zinciri baskısı nedeniyle sınırlıydı. Tükürük bazlı ters transkriptaz kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) testi, diğer test yöntemlerine duyarlılık ve özgüllük açısından karşılaştırılabilir olduğunu göstermiştir ve tükürük toplanması katılımcılar için fiziksel olarak daha az invazivdir. Sonuç olarak, Clemson Üniversitesi ve çevresindeki topluluğun nüfus sürveyansı için multipleks RT-qPCR tanısal bir test geliştirdik. Tahlilde, iş akışını ve sistem esnekliğini optimize etmek için karmaşık klinik otomasyon sistemleri yerine açık kaynaklı sıvı taşıma robotları ve termosikletler kullanıldı. Tükürük bazlı RT-qPCR’nin otomasyonu, hem büyük hem de küçük ölçekli test talepleri için çok çeşitli viral RNA konsantrasyonlarının hızlı ve doğru bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Otomatik sistem için ortalama geri dönüş, numunelerin %95’i için < 9 saat ve numunelerin %99'u için < 24 saat idi. Tek bir testin maliyeti, tüm reaktifler toplu miktarlarda satın alındığında 2,80 dolardı.

Introduction

Yeni bir koronavirüs olan şiddetli akut solunum sendromu ile ilişkili koronavirüs-2 (SARS-CoV-2), 2019’un sonlarında ortaya çıkmış ve küresel popülasyonlara hızla yayılmıştır1. SARS-CoV-2 enfeksiyonu, potansiyel olarak ciddi solunum ve enflamatuar semptomları olan oldukça bulaşıcı bir hastalık olan koronavirüs hastalığı 2019’a (COVID-19) neden olur. Yüksek bulaşıcılık, düşük mortalite ile birleştiğinde, virüsün popülasyonlar arasında hızla yayılacağını ve daha fazla tanı testi gerektireceğini göstermiştir2,3. Halk sağlığı önerileri, vakaları izole etmek ve daha sonra bulaşma oranlarını azaltmak için geniş çaplı nüfus taramasını teşvik etti4,5,6. Ayrıca, nüfus gözetimi modelleri, artan test sıklığının ve azalan raporlama süresinin, iletimi azaltmada, test duyarlılığını artırmaktan daha büyük bir etkiye sahip olduğunu ortaya koymuştur7. Bunun nedeni, enfekte olmuş bireylerin daha erken karantinaya alınabilmesi ve böylece enfeksiyon zincirlerinin kırılmasıdır.

Orijinal nükleik asit amplifikasyon testi (NAAT) standardı, RT-qPCR8 tarafından işlenen nazofaringeal (NP) çubuklardı. Bununla birlikte, çok büyük popülasyonlar için bu test biçimiyle birlikte, artan göreceli maliyet ve şiddetlenen tedarik zinciri baskısı gibi komplikasyonlar ortaya çıkmaktadır9,10. Ayrıca, yaygın NAAT yöntemlerinin (NP çubukları, orofaringeal çubuklar, orta konka çubukları ve burun çubukları dahil) hem numune toplanması hem de işlenmesi, özel ekipmana, reaktiflere ve tıbbi personele9,10 bağımlıdır.

NP sürüntü RT-qPCR testi için yeterli bir alternatif, SARS-CoV-2 tespiti için doğru bir tanı aracı olan tükürük bazlı testtir11,12,13,14. RT-qPCR’nin tükürük numuneleri üzerinde doğrudan gerçekleştirilmesi, NP swabs15 ile benzer duyarlılık ve özgüllük sağlar. Tükürük testinin NP sürüntü testine göre en büyük avantajlarından biri, numunelerin kendi kendine toplanmasına izin vermesidir16. Bu, tıbbi personel ihtiyacını en aza indirir ve NP çubuklarından daha az invaziv olarak hastalar için numune toplama kolaylığını en üst düzeye çıkarır. Ek olarak, tükürük numuneleri numuneyi bir çubuktan çıkarmak için tampon gerektirmediğinden (NP numunelerinde olduğu gibi), tükürük bazlı testler doğrudan ısı bazlı ribonükleik asit (RNA) ekstraksiyonunu kullanabilir, bu da ek tamponlara, taşıma ortamına ve/veya RNA ekstraksiyon reaktiflerine olan ihtiyacı ortadan kaldırarak test maliyetlerini azaltır14,17.

Clemson Üniversitesi Hastalık Teşhis ve Müdahale Araştırma ve Eğitim (REDDI) Laboratuvarı, üniversitenin COVID-19 testi ve gözetimi ihtiyaçlarını karşılamak için kurulmuştur. Üniversiteler de dahil olmak üzere kapalı popülasyonlarda, sosyal mesafe ile birlikte sık sürveyans testleri, hastalık prevalansının epidemiyolojik modellerinde en olumlu sonuçları vermiştir18. Konsolide CDC 2019-nCOV RT-qPCR19 ve SalivaDirect14 protokolleri uyarlandı ve maliyeti düşürmek ve geri dönüş süresini iyileştirmek için klinik iş akışında otomasyon kullanıldı. Önceki gruplar SARS-CoV-2 RNA ekstraksiyon adımları20,21 için açık kaynaklı sıvı taşıma robotları kullanmıştı, ancak test plakaları hazırlamak ve numuneleri yüklemek için robotların kullanımını en üst düzeye çıkardık22. Burada, uyarlanmış protokolün ve açık kaynaklı sıvı taşıma sistemlerinin kullanımının (Şekil 1) hızlı ve doğru tükürük bazlı RT-qPCR’ye izin verdiğini ve büyük ölçekli halk sağlığı gözetimi için etkili bir strateji olduğunu gösteriyoruz.

Protocol

Tüm araştırmalar Clemson Üniversitesi ve Prisma Health Kurumsal İnceleme Kurullarına (Prisma Health IRB # Pro00099491, 1 Temmuz 2020) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. Açık kaynaklı sıvı taşıma robotunun kurulumu Yüksek verimli partikül hava (HEPA) filtre modüllerini ( Malzeme Tablosuna bakınız) üreticinin talimatlarına göre her sıvı taşıma robotunun üstüne takın. Üreticinin talimatlarına uygun olarak ana karışım plakası hazırlama robotlarının sol montajına 8 kanallı bir P20 pipet takın. Üreticinin talimatlarına uygun olarak numune yükleme robotlarının sağ yuvasına bir P20 pipet takın. Özel Python betiklerini (Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2) uygun bilgisayarlara indirin. Örnek yükleme robotu bilgisayarlarındaki masaüstü uygulamasında TigerSaliva Full 384 Loading.py açın. Kalibre Et’e tıklayın ve hem pipeti hem de programı yazılım talimatlarına göre ayarlayın. Ana karışım robot bilgisayarındaki masaüstü uygulamasında 12 Tam Plates.py açın. Kalibre Et’e tıklayın ve hem pipeti hem de programı yazılım talimatlarına göre ayarlayın. Bilgisayar destekli tasarım (CAD) dosyası (https://www.myminifactory.com/object/3d-print-141363) kullanarak sigortalı biriktirme modellemeli üç boyutlu (3B) yazıcıyla özel numune rafları yazdırın. Sekiz raftan oluşan iki set için numune yükleme robotu başına 16 raf yazdırın. 2. 20x multipleks N1 + P1 prob / astar karışımının hazırlanması Sentetik SARS-CoV-2 RNA veya hasta örneklerinden uzakta steril bir ortamda 50 mL’lik bir konik tüp içinde 20x multipleks N1 + P1 prob / primer karışımı (toplam hacim 20 mL, Tablo 1) partisini hazırlayın. Aliquot 1.6 mL’lik karışımı serolojik bir pipet kullanarak steril 2.0 mL santrifüj tüplerine dönüştürür ve uygun şekilde etiketler. Alikotları kullanıma hazır olana kadar -20 °C dondurucuda saklayın. 3. Pozitif kontrol karışımının hazırlanması NOT: Pozitif kontrol karışımı, prob/astar karışımı veya diğer ana karışım bileşenleri ile aynı steril ortamda yapılmamalıdır. Ayrı bir nükleaz içermeyen su kabı kullanılmalıdır. SARS-CoV-2 sentetik RNA’yı (N1) 1.000.000 gen kopyası/μL’den (cpμ) 10.000 cpμ’ye kadar seyreltin ve 990 μL nükleaz içermeyen suya 10 μL stok çözeltisi ekleyin. Aliquot 25 μL 10.000 cpμ steril 0.2 mL tüplere yerleştirin ve uygun şekilde etiketleyin. Kullanılmayan alikotları -80 ° C’de saklayın.NOT: Sentetik RNA, bozulmayı önlemek için -80 ° C’de saklanmalıdır. 950 μL nükleaz içermeyen suya 50 μL stok çözeltisi ekleyerek Hs_RPP30 sentetik DNA’yı (P1) 200.000 cpμ’den 10.000 cpμ’ye kadar seyreltin. Aliquot 25 μL 10.000 cpμ steril 0.2 mL tüplere yerleştirin ve uygun şekilde etiketleyin. Kullanılmayan alikotları -80 ° C’de saklayın. Her bir bileşeni 20 μL SARS-CoV-2 ve Hs_RPP30 10.000 cpμ stoktan 960 μL nükleaz içermeyen suya ekleyerek 200 cpμ’lik bir nihai konsantrasyona seyreltin, toplam 1000 μL. Aliquot 20 μL karışık 200 cpμ pozitif kontrol 0.2 mL tüplere ve uygun şekilde etiketleyin. Alikotları kullanıma hazır olana kadar -80 ° C’de saklayın. 4. Ana karışım plakalarının hazırlanması NOT: Master karışımı sentetik SARS-CoV-2 RNA veya hasta örneklerinden uzakta steril bir ortamda yapın. Karışıma eklenmeden önce tüm bileşenler tamamen çözülmelidir; uygun çözülme olmadan, konsantrasyonlar yanlış olabilir. Yetersiz çözülme, buzun varlığı veya reaktiflerin düzensiz rengi ile gösterilir. Karışımı hazırlarken bir dondurucu bloğunda saklayın. 50 mL’lik bir konik tüp içinde bir grup multipleks ana karışım (toplam hacim 48 mL, Tablo 2) hazırlayın. Tüpü 3x’in üzerine çevirerek karışımı homojenize edin. Yukarı ve aşağı pipetleme veya vorteks yaparak karıştırmayın, çünkü bu enzime zarar verecektir. Her bir kuyucuğa 1,48 mL ana karışım aktararak steril 96 kuyucuk derinliğindeki kuyu haznesinin 1-4 sütunlarını doldurun. Bir 50 mL konik, 12 plaka için yeterli olan dört sütunu doldurur. Derin kuyu haznesini bir folyo conta ile örtün ve özel ana karışım sıvı işleme robotuna yerleştirin. Doldurulmuş derin kuyu haznesini güverte 10’a yerleştirin, 1-6 numaralı güvertelere altı boş 384 delikli plakayı ve P20 uç kutusunu güverte 11’e yerleştirin. Derin kuyu plakasını ve uç kutularını ortaya çıkarın ve robotu kapatın. Robot masaüstü uygulamasında Çalıştırmayı Başlat’a tıklayarak özel Python işletim protokolünü başlatın. 40 dakika sonra koşu duraklatılır. Doldurulmuş 384 kuyu plakasını robotta kalırken folyo contalarla örtün ve yapışmayı sağlamak için silindirle bastırın. Her plakanın kenarını bir parti tanımlayıcısıyla etiketleyin. 1-6 numaralı güvertelere altı yeni boş 384 delikli plaka yerleştirin ve Çalıştırmayı Sürdür’ü tıklatarak çalışma protokolüne devam edin. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, 384 kuyu plakasının son setini folyo contalarla örtün. Kalan ana plakanın 2 μL’lik pipeti, parti kalite kontrolü için boş bir 384 delikli plakanın 1-3 ve 22-24 numaralı sütunlarına karışır. Optik olarak şeffaf bir conta ile kapatın ve termosikler üzerinde çalıştırın (bölüm 10.1-10.2). Herhangi bir kuyu N1 eşik döngüsü (Ct) değerlerine sahipse veya 10’dan fazla kuyu P1 Ct değerlerine sahipse, parti kirlenmiştir ve kullanılamaz. Hazırlanan ana karışım plakalarını 4 °C’de saklayın ve hazırlandıktan sonraki 7 gün içinde kullanın. 5. Numune toplama, alma ve ısıl işlem Katılımcılara tükürük toplanmasından 30 dakika önce yeme, içme, sigara içme veya diş hijyeni uygulamaktan kaçınmalarını söyleyin. Katılımcılara ağızda doğal olarak biriken en az 1 mL tükürük toplamalarını ve koruyucu madde içermeyen steril 50 mL konik bir tüpe biriktirmelerini, ardından tüpü kapatmalarını söyleyin (Ek Dosya 3). Tükürük toplama tüplerinin dışını etanol veya dezenfekte edici mendillerle dekontamine edin ve test için laboratuvara aktarın. Her numune barkodunu günlük alım elektronik tablosuna tarayarak numune gelişini kaydedin (Ek Dosya 4). Taranan numunelere 95 °C’lik bir fırında 30 dakika boyunca ısıl işlem uygulayın. Isıya dayanıklı eldivenler giyerken numuneleri çıkarın.NOT: İşlenmemiş numuneler oda sıcaklığında (23 °C) 72 saate kadar stabildir. Isıl işlemden geçirildikten sonra, numuneler hemen işlenmiyorsa 4 ° C’de saklanmalıdır. 6. Örnek Atama Örnek atama istasyonundaki bilgisayarda her örnek yükleme robotu (Ek Dosya 5) için günlük örnek yükleme elektronik tablolarını açın. Her 384 kuyucuklu plakaya aşağıdaki gibi 188 numune atayın: 1-48 arası örnekler 1. çeyrek, 49-96 arası örnekler 2. çeyrek, 97-144 örnekleri 3. çeyrek ve 145-188 örnekleri 4. çeyrek olarak kabul edilir. Numune çift olarak analiz edilir. Tepsileri plaka adı, tarih ve çeyrek numara ile etiketleyin. Numuneleri, numune yükleme elektronik tablosuna sırayla tarayın.NOT: Önceki plakalardan alınan numunelerin, Şekil 3’te tanımlandığı gibi manuel olarak çalıştırılması gerekebilir. Manuel numune atama ve yükleme talimatları için bölüm 8.1-8.3’e bakın. 7. Numune yükleme robotlarının çalıştırılması Numune yükleme istasyonunda, robottaki güverte yerleşimine karşılık gelen sekiz adet 3D baskılı raftan oluşan iki tam set sıralayın. Çeyrek 1 tüplerin kapağını açın ve raf 1’deki A1 konumundan başlayarak 3D baskılı raflara yerleştirin. Her rafı soldan sağa ve yukarıdan aşağıya doğru doldurun. Bu yükleme düzenine raf 2’de devam edin, ardından raf 4 ve 5’e geçin ( Şekil 2C’ye bakın).NOT: Robot programı parametreleri nedeniyle raflar ardışık olarak numaralandırılmamaktadır. Yüklü çeyrek 1 numune raflarını güverte 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11’e yerleştirin. P20 uçlarını güverte 3 ve 9’a yerleştirin. Kurulum sürecini basitleştirmek için, malzemeleri robota arkadan öne doğru yükleyin. 4 °C’den önceden hazırlanmış bir ana karışım plakası alın, plaka adıyla etiketleyin ve kontrol kuyularının etrafındaki folyodaki bir çizgiyi kesmek için keskin bir bıçak kullanın (N23/24, O23/24 ve P23/24). Ana karışım plakasını güverte 6’ya yerleştirin ve kontrol kuyularını kaplayan küçük dikdörtgeni geride bırakarak folyo kapağını soyun. Uç kutularını ortaya çıkarın ve robotu kapatın. Robot masaüstü uygulaması üzerinden Çalıştırmayı Başlat’a tıklayarak özel Python işletim protokolünü başlatın. Her çeyrekte plakaya yüklenmesi 24,5 dakika sürer; hatırlatıcı olarak bir zamanlayıcı ayarlayın. Robot çalışırken, bölüm 7.2’de açıklandığı gibi çeyrek 2 numune tüpünün kapağını açın ve ikinci 3D baskılı raf setine yükleyin. Robot durakladığında, çeyrek 1 rafları çıkarın ve bunları çeyrek 2 raflarla değiştirin. Masaüstü uygulamasında Çalıştırmayı Sürdür’ü tıklatın. Çeyrek 1 numune tüplerini özetleyin ve sonuçları beklerken 4 ° C’lik bir buzdolabında saklayın.Bu yükleme işlemini 3. ve 4. çeyrekler için tekrarlayın. Yüklü plakayı bir biyogüvenlik kabinine aktarın. Kirlenmeyi en aza indirmek için, aktarım sırasında plakayı kapalı tutun. 8. Manuel numune yükleme NOT: Yetersiz robotik yükleme durumunda tekrarlanan örnekler üzerinde tek bir el ile çalıştırma gerçekleştirin (N1 Yeniden Çalıştırma veya Yeniden Çalıştırma, bkz. Şekil 3). Tekrarlanan örnekleri toplayın ve bunları 4. çeyrekteki son örnekler olarak atayın (bkz. bölüm 6.2). Numuneleri numaralandırın, barkodları tarayın ve orijinal numune konumunu girin ve numune yükleme elektronik tablosuna sonuç verin. Tekrarlanan numuneleri biyogüvenlik kabinine aktarın. Tekrarlanan numune tüplerini robot yükleme raflarına yüklemeyin. Her tekrarlanan numunenin 2 μL’lik pipeti, plaka düzen diyagramını izleyerek doğru kuyucuklara gider (Ek Dosya 6). Hasta numuneleri eklemek için belirlenmiş bir pipet kullanın. Kontaminasyonu en aza indirmek için numuneler eklerken kontrol kuyularını folyo ile kapalı tutun. 9. Test plakalarına kontrollerin eklenmesi Forseps kullanarak kontrol kuyuları üzerindeki folyo kapağını soyun. N23-N24 kuyularına 2 μL nükleaz içermeyen su (şablon kontrolü yok) ve O23-O24 kuyularına 200 cpμ karışık pozitif kontrolden 2 μL (bölüm 3’e bakınız) pipet. Doğrulanmış pozitif hasta numunesinin 2 μL’lik pipeti, ek bir kontrol olarak M23-M24 kuyularına kontrol edilir. Ana karışım parti kalitesini izlemek için P23-P24 kuyularını boş bırakın. Plakayı optik olarak şeffaf bir conta ile örtün ve tüm kuyucuklara sızdırmazlık yapıştırmak için aplikatör silindirini kullanın. Plakayı iyice karıştırmak için 30 saniye boyunca 2500 rpm’de vorteks. Plakayı 1 dakika boyunca 500 x g’de santrifüj yapın. 10. RT-qPCR Gerçekleştirme Termosikler yazılımında açıklanan koşullara göre bir protokol programı oluşturun (Tablo 3). Protokolü gelecekteki plakalar için saklayın. Sızdırmaz plakayı termosikler içine yerleştirin ve protokolü çalıştırın. Ct değerlerini .xslx dosyası olarak dışa aktarın ve değerleri örnek yükleme elektronik tablosuna kopyalayın (Ek Dosya 5).NOT: Bu sayfalar, üretici yazılımından Ct çıktı dosyaları için özel olarak tasarlanmıştır ve diğer biçimleri kabul etmek için değiştirilmesi gerekebilir. 11. Plaka geçerliliğinin belirlenmesi Plaka sonuçlarını geçerli olarak değerlendirmek için hem pozitif kontrolü hem de bilinen pozitif numuneleri ve negatif kontrolü doğrulayın. Kontrol kuyularını aşağıdaki kriterlerle değerlendirin. Pozitif kontrol için, en az bir pozitif kontrol kuyusunun (O23 / O24) hem P1 hem de N1 probları için 22-28 arasında Ct değerleri üretip üretmediğini kontrol edin. Alternatif olarak, bilinen pozitif numune kuyuları (M23 / M24), P1 ve N1 problarında P1 ve N1 Ct değerlerini <33 üretir. Negatif kontrol için, iki negatif kontrol kuyusundan birinde (N23/N24) N1 veya P1 Ct değeri olmadığını kontrol edin. Plakayı geçersiz kılmadan önce Ct değerlerinin geçerli amplifikasyon eğrilerine sahip olduğunu onaylayın. 12. Örnek sonuçların yorumlanması Diyagramı izleyerek hasta sonucunu belirleyin (Şekil 3) ve çözümlenmiş örnekleri raporlayın. P1 sonucunu GEÇERLİ veya GEÇERSİZ olarak değerlendirin. P1, Ct =33 sonucunu üretirse veya Ct değeri yoksa, kuyuyu GEÇERSİZ olarak düşünün. N1 Sonucunu EVET, HAYIR veya HAYIR* olarak değerlendirin. N1, Ct

Representative Results

Hem SARS-CoV-2 (N1) hem de Hs_RPP30 (P1) için sentetik nükleik asit içeriği için RT-qPCR probları ve primerleri için tespit aralığını belirledik. Sudaki kombine sentetik SARS-CoV-2 RNA ve sentetik Hs_RPP30 DNA’sının bilinen konsantrasyonlarının 10 kat seri seyreltilmesi yapıldı. Moleküler ağırlığı gen kopya sayısına dönüştürmek için aşağıdaki formül kullanılmıştır. Gen kopya sayısı = (ng * 6.0221 x 1023)/((baz çiftleri cinsinden uzunluk*660 g/mol) *1 x 109 ng/g) RT-qPCR uygulandı. RT-qPCR uygulandıktan sonra, N1 tespiti (Şekil 4A) ve P1 tespiti (Şekil 4B) için doğrusal eğriler, çok çeşitli gen kopya konsantrasyonlarında (sırasıyla R2 = 0.9975 ve R2 = 0.9884) iyi korelasyon katsayıları göstermiştir. Bu sonuç, primer ve prob setlerinin kombinasyonunun inhibitör olmadığını ve SARS-CoV-2 RNA’yı bir gen kopyasında / μL’de (Cq = 33) doğru bir şekilde tespit edebileceğini göstermektedir. Bir gen kopyası kabaca bir viral kopyaya eşdeğerdir; ancak RT-qPCR’nin yarı kantitatif yapısı nedeniyle tükürükte kantitatif viral kopya sayılarını belirlemedik. Pozitif tükürük örneklerini, bilinen konsantrasyonlardaki sentetik SARS-CoV-2 RNA’yı virüssüz tükürüğe (hem ısıl işlem görmüş hem de ısıl işlem görmemiş) çivileyerek simüle etmeye çalıştık, ancak düşük RNA konsantrasyonlarında N1 amplifikasyonu üretemedik (Veriler gösterilmedi). Bunun nedeni RNaz bozulması veya diğer kafa karıştırıcı faktörler olabilir. Otomatik ve manuel numune yükleme yöntemleri arasındaki tahliller arası ve tahlil içi değişkenlik de değerlendirilmiştir. Tahliller arası değişkenliği değerlendirmek için, kılavuz (bölüm 8.1-8.3’te açıklanmıştır) ve otomatik (bölüm 7.1-7.11’de açıklanmıştır) yöntemler kullanılarak 20 benzersiz pozitif numune yüklenmiştir. N1 Ct değerleri, sıvı elleçleme robotlarının ve manuel numune yüklemenin eşdeğer sonuçlar üretip üretmediğini belirlemek için karşılaştırıldı (Şekil 5A). Manuel ve otomatik yöntemler arasındaki doğrusal ilişki, her iki yöntemin de işlevsel olarak eşdeğer olduğunu gösteren yüksek bir korelasyon katsayısı (R2 = 0.9088) üretti. N1 Ct değerleri arttıkça, Ct değerlerinin değişkenliği de artmıştır. Bu eğilim muhtemelen, daha az parçacık bulunduğunda daha belirgin olan tükürük içindeki viral parçacıkların heterojen dağılımından kaynaklanmaktadır. Tahlil içi değişkenliği değerlendirmek için, her iki numune yükleme yöntemi kullanılarak benzersiz tükürük örneklerinin replikasyon kuyularından N1 Ct değerleri arasında bir karşılaştırma yapılmıştır (Şekil 5B). Otomatik numune yükleme replikaları arasındaki doğrusal ilişki (R2= 0.9622), manuel yüklemeninkinden (R2= 0.9589) biraz daha yüksek bir korelasyon katsayısı üretmiştir ve bu da her iki yükleme yöntemi için SARS-CoV-2 tespitinin yüksek tekrarlanabilirliğini göstermektedir. Son olarak, ısıl işlem yöntemlerine göre tükürük viskozitesinin azaltılmasının değerlendirilmesi yapılmıştır (Şekil 6). Tükürük, numune değişkenliğini ortadan kaldırmak için tek bir kaynaktan elde edildi. Bir ısıl işlem yönteminde P1 Ct değerlerinde daha fazla değişkenlik, viskoz tükürük tam olarak aspire edilemediği ve dağıtılamadığı için daha yüksek numune viskozitesinin göstergesi olabilir. Hem 30 dakika hem de 60 dakikalık ısıl işlem yöntemleri, hiçbir işlem kontrolüne kıyasla numune değişkenliğini önemli ölçüde azaltmıştır (sırasıyla p = 0.0006 ve p = 0.0429). 30 dakika ile 60 dakikalık tedaviler arasında anlamlı fark saptanmadı (p=0.2245); bu nedenle, işlem süresini azaltmak için 30 dakikalık ısıl işlem yöntemi uygulanmıştır. Şekil 1: Tükürük bazlı RT-qPCR tanılama sistemini kullanan laboratuvar iş akışı . (A) Numuneler toplanır ve 95 °C’de 30 dakika boyunca ısıl işlemden geçirilir. Tedavi edilen numuneler, şirket içi elektronik tablo sistemi aracılığıyla hasta bilgileriyle birlikte sıralanır ve izlenir. Bir sıvı taşıma robotu, numuneleri hazırlanan ana karışım plakalarının yinelenen kuyularına yükler. Bir teknisyen kontrolleri manuel olarak yükler, plakayı kapatır ve plakayı işlenmek üzere bir termosikler içine yerleştirir. Sonuçlar otomatik bir bilgisayar sistemi aracılığıyla analiz edilir ve bir teknisyen tarafından doğrulanır. (B) Bir teknisyen, steril bir biyogüvenlik kabinindeki derin bir kuyu rezervuarına eklenen ana karışım için reaktifler hazırlar. Doldurulmuş derin kuyu rezervuarları, özel bir sıvı taşıma robotuna yüklenir. Tamamlanan plakalar folyo ile kapatılır, etiketlenir ve 4 ° C’de saklanır . Şekil 2: Sıvı taşıma robotu için kullanılan düzenler . (A) Ana karışım plakası hazırlama robotları için güverte düzeni. Sekiz kanallı pipetle robot, pipet uçlarını almak, ana karışımı 96 delikli derin bir kuyu haznesinden aspire etmek, ana karışımı boş 384 delikli plakalara dağıtmak ve pipet uçlarını bir çöp kutusuna atmak üzere programlanmıştır. Bu, çalışma başına altı plaka için tekrarlanır. (B) Örnek yükleme robot(lar)ı için güverte kurulumu. Tek kanallı pipetle robot, bir pipet ucu almak, bir tükürük numunesini aspire etmek, tükürük numunesini 384 delikli bir ana karışım plakasının yinelenen kuyucuklarına dağıtmak ve pipet ucunu bir atık kutusuna atmak üzere programlanmıştır. Bu, çalıştırma başına 48 örnek için tekrarlanır. (C) 3D baskılı raflar için örnek tüp yükleme siparişi. Kırmızı oklar bir raf içindeki yükleme sırasını gösterir ve beyaz kutulu sayılar tüm raf kümesinin yükleme sırasını gösterir. Tüm kurulum, 188 numuneyi 384 kuyucuklu bir plakaya çift olarak yükleyecektir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Örnek sonuç akış şeması. Geçerli P1 ve pozitif N1 içeren örneklerin SARS-CoV-2 için pozitif insan tükürük örnekleri olduğu belirlenmiştir. Geçerli ve pozitif/negatif örneklem sonuçları kesin olarak kabul edildi. İlk çalıştırmada kesin sonuçlar vermeyen örnekler Rerun (RR ile gösterilir) veya N1 Rerun (N1 RR ile gösterilir) olarak kategorize edildi. Yeniden çalıştırma örneklerinin geçerli bir P1 amplifikasyonu yoktu ve N1 Rerun örneklerinin tek bir çoğaltmada pozitif N1 amplifikasyonu vardı. Sonraki bir manuel çalıştırma ile geçerli bir P1 amplifikasyonu üretilemezse veya her iki replikasyon da pozitif eşiğin üzerinde N1 Ct değerlerine sahipse (Ct >33), örnek sonuçları sonuçsuz olarak kabul edildi. Klinik amaçlar için, laboratuvara ulaşmayan, pipete tükürük miktarı yetersiz olan veya hasar gören hasta örnekleri geçersiz kabul edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: N1 (SARS-CoV-2) sentetik RNA ve P1 (Hs_RPP 30) sentetik DNA’nın RT-qPCR tespiti. Standart eğriler, bu prob/astar kombinasyonunu kullanarak doğru algılama aralığını belirlemek için standart sapmalarla çizildi. (A) İlgili seyreltmelerde elde edilen ortalama Ct değerleri (n =4), tahmini sentetik RNA miktarına (10 μL RT-qPCR reaksiyonunda 1×100 ila 1×104 RNA kopyaları) karşı çizilmiştir. (B) İlgili dilüsyonlarda elde edilen ortalama Ct değerleri (n =3), sentetik DNA’nın tahmini miktarına (10 μL RT-qPCR reaksiyonunda 1 x 100 ila 1 x 104 gen kopyası) karşı çizilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Manuel ve otomatik tükürük transferi SARS-CoV-2 (N1) Ct değerleri arasındaki karşılaştırma. Bilinen SARS-CoV-2 pozitif tükürük örnekleri (n = 20), bir sıvı işleme robotu tarafından bir RT-qPCR ana karışım plakasına çift olarak yüklendi. Numuneler N1 için 18-32 arasında değişen bir Ct değerine sahiptir. Aynı numuneler daha sonra farklı bir plaka konumundaki yinelenen kuyucuklara manuel olarak yüklendi. (A) Hem robot hem de manuel numune yüklemesi kullanılarak benzersiz numunelerden elde edilen N1 Ct değerleri, manuel ve robot yükleme arasındaki tahliller arası değişkenliği belirlemek için aktarılmıştır. (B) Tahlil içi değişkenlik, hem robot hem de manuel numune yüklemesinden elde edilen N1 Ct değerlerinin transpoze replikasyonu kullanılarak da belirlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Tükürükte viskozitenin azaltılması için ısıl işlem yöntemlerinin değerlendirilmesi. SARS-CoV-2 negatif tükürük tek bir kaynaktan toplandı ve alikotlar 95 ° C’de 0 dakika, 30 dakika veya 60 dakika boyunca ısıl işlem gördü. Tedavi yöntemleri arasındaki değişkenliği belirlemek için her bir durumun teknik replikalarından (n = 12) P1 Ct değerleri çizildi. Gruplar arasındaki ikili karşılaştırmalar eşlenmemiş bir t-testi ile değerlendirildi (*** p <0.001, * p <0.05) gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Ek Şekil 1: Düşük P1 Ct tükürük örneklerinde N1 Ct’nin karşılaştırılması. Düşük P1 Ct olan pozitif örnekler seçildi ve N1 Ct (n = 106) ile karşılaştırıldı. N1 Ct değerleri 14-33 arasında değişmiştir, bu da tahlilin tükürük örneklerinde standart eğriyle karşılaştırılabilir dinamik bir aralığa sahip olduğunu göstermektedir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Parça Sıra (5’→3′) Stok Konsantrasyonu Hacim 2019-nCoV-N1 Probu /5FAM/ACCCCGCAT/ZEN/TACGTTTGGTGGACC/3IABkFQ 50 μM 500 μL 2019-nCoV-N1-İçin GACCCCAAAATCAGCGAAAT 100 μM 2000 μL 2019-nCoV-N1-Devir TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG 100 μM 2000 μL Hs RPP30 Cy5 Probu /5Cy5/TTCTGACCT/ZEN/GAAGGCTCTGCGCG/3IABkFQ 50 μM 500 μL Hs-RPP30-İçin AGATTTGGACCTGCGAGCG 100 μM 2000 μL Hs-RPP30-Devir GAGCGGCTGTCTCCACAAGT 100 μM 2000 μL Su – – 11000 μL Tablo 1: N1+P1 prob/astar karışımının bileşenleri. Parça Stok Konsantrasyonu Reaksiyon başına hacim Son Konsantrasyon Toplu İş Hacmi Luna WarmStart RT Enzim Karışımı 20X 0,5 μL 1X 3 mL Luna Tampon Reaksiyon Karışımı 2X 5,0 μL 1X 30 mL N1+P1 Astar/Prob Karışımı nCoV N1 F: 10 μM 0,5 μL 500 nM 3 mL nCoV N1 R: 10 μM 500 nM Prob nCoV N1: 2,5 μM 125 milyon RPP_30 P1 F: 10 μM 500 nM RPP_30 P1 R: 10 μM 500 nM Prob RPP_30 P1: 2,5 μM 125 milyon Nükleaz İçermeyen Su — 2 μL — 12 mL Ara toplam — 8 μL — 48 mL Şablon 2 μL Tablo 2: Multipleks SARS-CoV-2 ana karışımının bileşenleri. Safha Sıcaklık (°C) Süre Döngü Sayısı Ters Transkripsiyon 55 10 dk 1 İlk Denatürasyon 95 1 dk 1 Gol 95 10 saniye 3 72 30 saniye 95 10 saniye 3 69 30 saniye 95 10 saniye 3 66 30 saniye Ana Amplifikasyon 95 10 saniye 40 65 30 saniye Tablo 3: Touchdown RT-qPCR protokolü. Tek adımlı RT-qPCR SARS-CoV-2 tanısal testi için termosiklet koşulları. Touchdown Adımı Touchdown Adımı Yok Ortalama N1 Ct Ortalama P1 Ct Ortalama N1 Ct Ortalama P1 Ct Örnek 1 19.65 22.7 27.8 28.3 Örnek 2 22.24 24.9 28.77 30.5 Örnek 3 18.85 19.2 24.65 25.9 Örnek 4 25.56 22.8 31.93 29.2 Örnek 5 22.34 24.8 38.48 40.0 (Başarısız algılama) Tablo 4: Beş pozitif numune için touchdown Ct değerlerinin hiçbir touchdown Ct değeri ile karşılaştırılması. Örnek KaplanTükürük Ticari olarak temin edilebilen tükürük bazlı SARS-CoV-2 testi N1 Ct P1 Ct Covid-19 Değeri RNaseP Değeri D11 Serisi 16.4 18.1 20.86 23.4 E11 Serisi 18.9 19.1 25.6 21.2 F11 Serisi 19.5 18.4 22.8 22.2 G11 Serisi 22.2 19.1 23.7 22.9 H11 26.4 21.3 32.2 26.7 A12 Serisi 14.8 16.5 29.15 19 B12 Serisi 24 19.6 31.05 21.35 C12 Serisi 14.9 17.5 20.84 18.9 Tablo 5: TigerSaliva Ct sonuçları ile ticari olarak temin edilebilen tükürük bazlı SARS-CoV-2 tahlil sonuçlarının karşılaştırılması. Her iki tahlil de aynı tükürük örnekleri üzerinde yapıldı (n = 8). Ek Dosya 1: Robot ana karışım plakası oluşturma için özel komut dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 2: Örnek yükleme robotlarında tükürük işleme için özel komut dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 3: Katılımcılardan yüksek kaliteli tükürük örneklerinin kendi kendine toplanması için talimatlar. Daha fazla ayrıntı, https://www.clemson.edu/centers-institutes/reddilab/index.html’da bulunan test sürecinin kısa video açıklamasında bulunabilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Dosya 4: Örnek alım elektronik tablosu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 5: Örnek yükleme elektronik tablosu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 6: Örnek 384 delikli plaka düzen diyagramı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Protokolde açıklanan tahlil, bağımsız bir doğrulama çalışması ile değerlendirilmiştir. Aynı anda alınan eşleştirilmiş nazofaringeal sürüntülere karşı değerlendirildiğinde tahlilin %98.9 özgüllük (%1.1 yanlış pozitif) ve %90.0 duyarlılık (%10.0 yanlış negatif) olduğu saptandı (n=837; 817 negatif, 20 pozitif). Önemli olarak, TigerSaliva ile pozitif ve nazofaringeal sürüntü ile negatif test edilen üç katılımcı, 48 saat sonra sürüntülerle tekrar test edildi ve pozitif sonuçlar verdi, bu da TigerSaliva’nın SARS-CoV-2 enfeksiyonlarını hastalık sırasında daha erken tespit edebileceğini gösterdi.

Virüssüz tükürüğü (hem ısıl işlem görmüş hem de ısıl işlem görmemiş) SARS-CoV-2 sentetik RNA’nın bilinen konsantrasyonlarıyla simüle ederek pozitif tükürük örneklerini simüle ettik ve tükürükte Ct sınırını belirlemek için 10 kat seyreltme gerçekleştirdik. N1 geni, simüle edilmiş pozitif örneklerde 10.000 gen kopyasının (yaklaşık Ct = 28) altında tespit edilemedi. Bunun RNase bozulmasından veya diğer kafa karıştırıcı faktörlerden kaynaklandığından şüpheleniyoruz. Bununla birlikte, tükürük RNazlarının çıplak sentetik RNA ile etkileşimi, ısı ile denatüre edildikten sonra bile, viral parçacıklarla etkileşimden farklıdır. Ct >30 ile pozitif tükürük örnekleri tanımlandı ve harici laboratuvarlar bu örneklerden SARS-CoV-2 genetik dizi verilerini elde etti. Viral proteinlerin hasta tükürük örneklerinde RNA bozulmasına karşı koruma sağladığını düşünüyoruz.

Protokoldeki en kritik adım, ana karışım hazırlama ve tükürük numunesi işleme için otomasyonun uygulanmasıdır (sırasıyla bölüm 4 ve 7). Bu, geri dönüş süresini önemli ölçüde azaltan örtüşen görev süreçlerine izin verir. Bir diğer kritik adım klinik sonuç yorumlamasıdır (bölüm 11 ve 12). Ara sonuç kategorilerinin (Yeniden Çalıştır ve N1 Yeniden Çalıştır) oluşturulması, sonuçsuz test sonuçlarının ortaya çıkmasını da en aza indirdi.

Manuel ve otomatik tükürük numunesi yükleme yöntemleri arasındaki varyasyonun ihmal edilebilir olduğunu (Şekil 5A) ve otomasyonun SARS-CoV-2 tespitinin tekrarlanabilirliğini artırabileceğini gösterdik (Şekil 5B). Klinik laboratuvarları tasarlarken ve genişletirken testleri kolaylaştırmak için otomasyon tercih edilmelidir25. Laboratuvar iş akışı, robot otomatik görevlerin uygulanmasıyla iyileştirilmiştir26. Sıvı taşıma robotlarının açık kaynaklı yetenekleri, protokol tasarımı için özel komut dosyalarının uygulanmasına izin verir. Bu, sıvı taşıma robotlarını geleneksel klinik otomasyon yöntemlerine kıyasla ucuz ve oldukça değiştirilebilir bir sistem haline getirir. Aynı zamanda son derece tekrarlayan laboratuvar görevlerini yerine getirmek için ideal bir stratejidir. Sistemin yüksek düzeyde özelleştirilebilirliği, kıtlık durumunda laboratuvar gereçlerini (ör. toplama tüpleri, pipet uçları veya 384 delikli plakalar) değiştirme özgürlüğü anlamına gelir. Bu nedenle, sıvı taşıma robotlarını kullanarak otomasyon, hem büyük ölçekli hem de küçük ölçekli gözetim ve araştırmalar için uygundur.

Bu test stratejisinin en büyük avantajı, diğer klinik laboratuvarlara göre çok daha kısa bir geri dönüş süresidir. Otomatik sıvı taşıma robotlarının kullanımı, geri dönüş süresinin azaltılmasında önemli bir rol oynar, ancak robotların ve termosikleticilerin eşzamanlı kullanımı da test verimliliğini en üst düzeye çıkarmada etkilidir. Bir robot ve termosikler, her iki makinenin de kesintisiz numune yükleme ve numune sonuç analizi için birlikte kullanıldığı bir çift olarak çalıştırılmalıdır. Atanan numunelerin sabit bir akışı sağlandıktan sonra, tüm makine çiftleri aynı anda çalıştırılabilir. Robotların ve termosikletlerin sürekli eşzamanlı kullanımı, yüksek test hacmine uyum sağlamak için çok önemli olan test kapasitesini ve verimliliğini büyük ölçüde artırır.

Diğer yerleşik SARS-CoV-2 RT-qPCR protokollerinin aksine, probun ve astar setlerinin hedef genlere27 tavlanmasını iyileştirmek ve başarısız amplifikasyon riskini azaltmak için termosikler protokolüne bir touchdown adımı ekledik. Sonuçlar, touchdown’ın spesifik astar bağlanma kaybı riski olmadan pozitif numunelerin tespitini iyileştirdiğini göstermiştir (Tablo 4). Hem SARS-CoV-2 RNA kopyalarının (Şekil 4A) hem de Hs_RPP30 DNA kopyalarının (Şekil 4B) geniş bir yelpazesinin RT-qPCR testi ile aynı anda tespit edilebileceğini belirledik.

Sıvı taşıma robotlarının bir sınırlaması, tükürük transferi sırasında pozitif numunelerden çapraz kontaminasyon olasılığıdır. Tükürük viskoelastik bir sıvıdır28 ve pipet ucundan dağıtıldıktan sonra bitişik kuyucuklar boyunca dizilebilir. Ayrıca, tükürüğün heterojenliği29, viral parçacıkların numune boyunca eşit olmayan dağılımına neden olabilir. Bu, hem yanlış pozitiflerin hem de negatiflerin olasılığını artırır ve N1 Rerun ve Rerun örneklerinin atanmasını gerektirir. Bununla birlikte, başlangıçta N1 Rerun olarak belirlenen numunelerin% 14.1’i SARS-CoV-2 için pozitif olarak çözüldü ve yeniden testten sonra Rerun numunelerinin pozitif olarak çözülme olasılığı 30 kat daha fazlaydı. Sonuç olarak, Rerun’u N1 Rerun’dan (Şekil 3) ayırt etmek, potansiyel olarak pozitif numunelerin daha doğru bir şekilde ayrılmasına izin vererek tanısal tahlilimizin duyarlılığını ve özgüllüğünü arttırdı. Tanısal tükürük testi için ortaya çıkan diğer parametreler bu ayrımı yapmamıştır12,14,24,30,31.

Tükürük örneklerinin heterojenlik ve viskozite nedeniyle pipet edilmesi zor olabilir32. Isıl işlem, tükürük biyomatrisindeki proteinleri yeterince denatüre eder, viskoziteyi azaltır ve pandeminin ilk aşamalarında az bulunan RNA ekstraksiyon reaktiflerine9 olan ihtiyacı ortadan kaldırır10. Genişletilmiş ısıl işlem, mevcut virüsleri33 etkisiz hale getirir ve bu da daha düşük biyogüvenlik seviyelerinde laboratuvar işlemesine olanak tanır. Sonuç olarak, protein denatürasyonu yoluyla viskoziteyi azaltmak için ısı bazlı bir RNA ekstraksiyonu (bölüm 5.4’te tanımlanmıştır) uygulanmıştır (Şekil 6). Sonuçlara dayanarak, ısıl işlemin protein biyomatriksinin denatüre edilmesine ek olarak tükürük örneklerini de homojenize edebileceğini varsayıyoruz. Diğer gruplar, homojenliği artırmak için ısıl işlem ve proteinaz K işlemini birleştirdi9,14,34. Bu adımı, virion proteinlerini viral RNA’yı ısı bozulmasına maruz bırakacak bir oranda denatüre edebileceğinden uygulamamayı seçtik35. Ayrıca, proteinaz K ile numune seyreltmesi, daha az viral partikül içeren pozitif numuneleri maskeleyebilir ve böylece duyarlılığı azaltabilir. Ek olarak, tahlil sonuçları, manyetik boncuk RNA ekstraksiyonu kullanan ticari olarak temin edilebilen tükürük bazlı SARS-CoV-2 testi (Logix Smart COVID-19) ile karşılaştırılmıştır (Tablo 5). Mevcut tahlilin, ticari olarak temin edilebilen tahlille karşılaştırıldığında zayıf pozitif numunelerin tespitinde daha uygun olduğu bulunmuştur.

Sadece RT-qPCR kullanarak tükürükteki virüs kopya sayısını ölçmek zordur, çünkü qPCR yarı kantitatiftir. Ct değerleri arasında teknik sınırlamalardan kaynaklanan doğal farklılıklar vardır. Gen kopya sayısı Ct değerlerinden belirlenebilir (Şekil 4) ve kabaca viral kopya sayısına eşdeğerdir. Tükürük örneklerinde viral kopya sayısını belirlemek için olası bir çözüm, reaksiyondaki gen kopyalarının sert bir şekilde ölçülmesini sağlayan ddPCR’dir. Bununla birlikte, klinisyenlere kalitatif sonuçlar vermenin yeterli olduğuna ve göreceli viral içeriğin yöntemlerimizle işlenen örnekler arasında karşılaştırılabileceğine inanıyoruz.

Tükürük kullanırken ortaya çıkan bazı sınırlamalara rağmen, tükürük bazlı RT-qPCR ile SARS-CoV-2 testi, herhangi bir test ölçeğinde hızlı ve güvenilir viral RNA tespiti için etkili bir yöntem olduğunu kanıtlamaktadır. Bu, özellikle açık kaynaklı sıvı taşıma sistemlerinin kullanımı ile birleştiğinde geçerlidir. Bu test yaklaşımı, bulaşıcı hastalık ajanları, hastalık belirteçleri veya diğer virüsler gibi tanı ile ilgili diğer nükleik asit dizilerini tespit etmek için değiştirilebilir. Bu, tahlili hem klinik hem de araştırma teşhis çabaları için uygulanabilir kılar.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, SARS-CoV-2 testinin uygulanmasına ve yönetilmesine yardımcı olan Clemson’un yönetimine, tıbbi personeline ve REDDI Laboratuvarı’ndaki klinik laboratuvar çalışanlarına teşekkür ediyor. Güney Carolina Üniversitesi’nden Dr. Phillip Buckhaults ve Dr. Carolyn Bannister’a ekipman tedariki için ilk proje danışmanlığı ve endüstri bağlantıları için teşekkür ederiz. Örnek toplama konusundaki yardımları için birçok öğrenciye, profesöre ve personele teşekkür ederiz. Standart eğri veri toplama için Creative Inquiry öğrencilerine teşekkür ederiz. Bu çalışmanın finansmanı, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi P20GM121342 (DD ve LGP’ye verilir), Clemson Atletik Bölümü, Clemson Üniversitesi Araştırma Başkan Yardımcısı ve Güney Carolina Valisi ve Ortak Tahvil İnceleme Komitesi’nden alınmıştır.

Materials

100% EtOH Fisher scientific 22-032-601
20 uL Filtered Pipette Tips Opentrons 20uL tips
2mL Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 14-666-313 Alternate product may be used
Armadillo PCR Plate, 384-well, clear, white wells Thermo Scientific AB3384 Alternate product may be used
Celltreat 2mL 96 Deep Well Plates Fisher Scientific 50-828-743 For mastermix preparation
Clear PCR Sealing Sheets Thermo Scientific AB0558 Alternate product may be used
DPEC Treated Water Ambion (Thermo Scientific) AM9916
Flip Cap 50 mL Conical Tubes VWR 75845-210 For sample collection
Foil PCR Sealing Sheets Thermo Scientific AB0626 For storage of mastermix plates, Alternate product may be used
HS_RPP30 Synthetic DNA Integrated DNA Technologies 299788131 P1 positive control
Luna Buffer Probe One-Step Reaction New England Biolabs M3006B
Luna WarmStart RT Enzyme Mix New England Biolabs M3002B
nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol Integrated DNA Technologies 10006830
nCOV_N1 Probe Aliquot, 50 nmol Integrated DNA Technologies 10006832 Probe can be synthesized by other vendors with SYBR or FAM fluophores
nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmol Integrated DNA Technologies 10006831
Opentron HEPA Filter Module Opentrons N/A Not required, but useful to reduce contamination
Opentron Multichannel Attachment, P20 Opentrons 999-00005 For mastermix preparation
Opentron OT-2 Liquid Handling Robot Opentrons OT-2
Opentron Pipette Attachment, P20 Opentrons 999-0000215 For sample loading
Oven Memmert UF450 PLUS 208V-3PH
PCR Tubes (rnase, dnase free) Fisher Scientific 14-230-225 For aliquots of positive and neg controls
PolarSafe Aluminum Cooling Block, 15-Well (1.5/2.0 mL Tubes) VWR 10808-952
PolarSaf Aluminum Cooling Block, 24-Well (0.5mL tubes) VWR 10808-956
RNAse P (ATTO 647) Probe, 50 nmol Integrated DNA Technologies 10007062 Probe can be synthesized by other vendors with Cy5 fluorophore
RNAse P Forward Primer, 100nmol Integrated DNA Technologies 10006836
RNAse P Reverse Primer, 100 nmol Integrated DNA Technologies 10006837
Sars-CoV-2 Synthetic RNA Control 2 Twist Biosciences 102024 / 103907 / 103909 N1 Positive Control
Scanners Code CR1500 Only required when scaling up
Small HEPA Filtered Hood Erlab Captair Bio 321 For mastermix preparation
Thermocycler CFX384 Touch Biorad CFX384 Touch Alternate models can be used, e.g. CFX384 Opus
X-acto Knife Set Staples N/A To cut foil for keeping control wells covered
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhu, N., et al. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. New England Journal Medicine. 382 (8), 727-733 (2020).
  2. Chen, J. Pathogenicity and transmissibility of 2019-nCoV-A quick overview and comparison with other emerging viruses. Microbes and Infection. 22 (2), 69-71 (2020).
  3. Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. The Lancet. Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  4. Honein, M. A., et al. Summary of Guidance for Public Health Strategies to Address High Levels of Community Transmission of SARS-CoV-2 and Related Deaths, December 2020. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (49), 1860-1867 (2020).
  5. Surveillance strategies for COVID-19 human infection: interim guidance. World Health Organization Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051 (2020)
  6. Screening testing for early detection of SARS-CoV-2 infection. Division of viral diseases. Centers for Disease Control Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance (2020)
  7. Larremore, D. B., et al. Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 screening. Science Advances. 7 (1), 5393 (2021).
  8. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2. JAMA. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  9. Chu, A. W., et al. Evaluation of simple nucleic acid extraction methods for the detection of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal and saliva specimens during global shortage of extraction kits. Journal of clinical virology: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104519 (2020).
  10. Guan, D., et al. Global supply-chain effects of COVID-19 control measures. Nature Human Behaviour. 4 (6), 577-587 (2020).
  11. Bastos, M. L., Perlman-Arrow, S., Menzies, D., Campbell, J. R. The Sensitivity and Costs of Testing for SARS-CoV-2 Infection With Saliva Versus Nasopharyngeal Swabs: A Systematic Review and Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 174 (4), 501-510 (2021).
  12. Pasomsub, E., et al. Saliva sample as a non-invasive specimen for the diagnosis of coronavirus disease 2019: a cross-sectional study. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 27 (2), (2021).
  13. To, K. K., et al. Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of The Infectious Diseases Society of America. 71 (15), 841-843 (2020).
  14. Vogels, C. B., et al. SalivaDirect: A simplified and flexible platform to enhance SARS-CoV-2 testing capacity. Med (New York, N.Y.). 2 (3), 263-280 (2021).
  15. Griesemer, S. B., et al. Evaluation of Specimen Types and Saliva Stabilization Solutions for SARS-CoV-2 Testing. Journal of Clinical Microbiology. 59 (5), 1418-1420 (2021).
  16. Wehrhahn, M. C., et al. Self-collection: An appropriate alternative during the SARS-CoV-2 pandemic. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 128, 104417 (2020).
  17. Barza, R., Patel, P., Sabatini, L., Singh, K. Use of a simplified sample processing step without RNA extraction for direct SARS-CoV-2 RT-PCR detection. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 132, 104587 (2020).
  18. Paltiel, A. D., Zheng, A., Walensky, R. P. Assessment of SARS-CoV-2 Screening Strategies to Permit the Safe Reopening of College Campuses in the United States. JAMA Network Open. 3 (7), 2016818 (2020).
  19. 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Primers and Probes. U.S. Department of Health and Human Services Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html (2020)
  20. Cresswell, K., Ramalingam, S., Sheikh, A. Can Robots Improve Testing Capacity for SARS-CoV-2. Journal of Medical Internet Research. 22 (8), 20169 (2020).
  21. Villanueva-Cañas, J. L., et al. Implementation of an open-source robotic platform for SARS-CoV-2 testing by real-time RT-PCR. PLoS One. 16 (7), 0252509 (2021).
  22. Robot Boosts COVID-19 Testing Efficiency. University of South Carolina College of Pharmacy Available from: https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php (2020)
  23. Matic, N., et al. Practical challenges to the clinical implementation of saliva for SARS-CoV-2 detection. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology. 40 (2), 447-450 (2021).
  24. Sahajpal, N. S., et al. SalivaSTAT: Direct-PCR and Pooling of Saliva Samples Collected in Healthcare and Community Setting for SARS-CoV-2 Mass Surveillance. Diagnostics. 11 (5), 904 (2021).
  25. Genzen, J. R., et al. Challenges and Opportunities in Implementing Total Laboratory Automation. Clinical Chemistry. 64 (2), 259-264 (2018).
  26. Archetti, C., Montanelli, A., Finazzi, D., Caimi, L., Garrafa, E. Clinical Laboratory Automation: A Case Study. Journal of Public Health Research. 6 (1), 881 (2017).
  27. Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20 (3), 478-485 (1996).
  28. Bhat, P. P., et al. Formation of beads-on-a-string structures during break-up of viscoelastic filaments. Nature Physics. 6, 625-631 (2010).
  29. Miller, C. S., et al. Current developments in salivary diagnostics. Biomarkers in Medicine. 4 (1), 171-189 (2010).
  30. Moreno-Contreras, J., et al. Saliva Sampling and Its Direct Lysis, an Excellent Option To Increase the Number of SARS-CoV-2 Diagnostic Tests in Settings with Supply Shortages. Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 01659 (2020).
  31. Wang, W., et al. Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens. JAMA. 323 (18), 1843-1844 (2020).
  32. Landry, M. L., Criscuolo, J., Peaper, D. R. Challenges in use of saliva for detection of SARS CoV-2 RNA in symptomatic outpatients. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 130, 104567 (2020).
  33. Lista, M. J., et al. Resilient SARS-CoV-2 diagnostics workflows including viral heat inactivation. PLoS One. 16 (9), 0256813 (2021).
  34. Brotons, P., et al. Validation and implementation of a direct RT-qPCR method for rapid screening of SARS-CoV-2 infection by using non-invasive saliva samples. International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of The International Society for Infectious Diseases. 110, 363-370 (2021).
  35. Batéjat, C., Grassin, Q., Manuguerra, J. C., Leclercr, I. Heat inactivation of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2. Journal of Biosafety and Biosecurity. 3 (1), 1-3 (2021).

Tags

Keywords Extracted From The Given Text:SARS-CoV-2Quantitative Reverse Transcriptase PCRSaliva DiagnosticOpen-source Pipetting RobotsCOVID-19 DiagnosticsSaliva-based TestingAutomated Parallel WorkflowsSample DecontaminationHeat TreatmentSample LoadingSample Assignment3D Printed RacksMaster Mix PlatesPython Operating Protocol

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ham, R. E., Smothers, A. R., King, K. L., Napolitano, J. M., Swann, T. J., Pekarek, L. G., Blenner, M. A., Dean, D. Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots. J. Vis. Exp. (180), e63395, doi:10.3791/63395 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image