オープンソースピペッティングロボットを活用した効率的なSARS-CoV-2定量逆転写酵素PCR唾液診断戦略

すべての研究は、クレムソン大学およびPrisma Health Institutional Review Boards(Prisma Health IRB # Pro00099491、July 1, 2020)に準拠して実施されました。 1. オープンソースの液体処理ロボットのセットアップ メーカーの指示に従って、高効率微粒子空気(HEPA)フィルターモジュール( 材料表を参照)を各液体処理ロボットの上部に取り付けます。 メーカーの指示に従って、マスターミックスプレート調製ロボットの左マウントに8チャンネルP20ピペットを取り付けます。 メーカーの指示に従って、サンプルローディングロボットの右側のマウントにP20ピペットを取り付けます。 カスタム Python スクリプト (補足ファイル 1 および 補足ファイル 2) を適切なコンピューターにダウンロードします。 TigerSaliva Full 384 Loading.py をデスクトップアプリケーションで開き、サンプルローディングロボットコンピュータで使用します。「キャリブレーション」をクリックし、ソフトウェアの指示に従ってピペットとプログラムの両方を設定します。 マスターミックスロボットコンピューターのデスクトップアプリケーションで 12フル Plates.py を開きます。 「キャリブレーション 」をクリックし、ソフトウェアの指示に従ってピペットとプログラムの両方を設定します。 コンピュータ支援設計(CAD)ファイル(https://www.myminifactory.com/object/3d-print-141363)を使用して、溶融堆積モデリング3次元(3D)プリンタでカスタムサンプルラックを印刷します。サンプルローディングロボットあたり16ラックを印刷し、2セットの8ラックに対して印刷します。 2. 20倍マルチプレックスN1+P1プローブ/プライマーミックスの調製 合成SARS-CoV-2 RNAまたは患者検体から離れた滅菌環境で、50 mL 円錐管内に 20 x マルチプレックス N1+P1 プローブ/プライマーミックス (総容量 20 mL、 表 1) のバッチを調製します。 血清学的ピペットを用いて混合物1.6 mLを滅菌2.0 mL遠沈管にアリコートし、適切に標識した。 アリコートは、使用準備が整うまで-20°Cの冷凍庫に保管してください。 3. ポジティブコントロールミックスの調製 注: ポジティブコントロールミックスは、プローブ/プライマーミックスまたは他のマスターミックス成分と同じ滅菌環境で作成しないでください。ヌクレアーゼを含まない水の別の容器を使用する必要があります。 990 μLのヌクレアーゼフリー水に10 μLのストック溶液を加えることにより、SARS-CoV-2合成RNA(N1)を1,000,000遺伝子コピー/μL(cpμ)から10,000cpμに希釈する。滅菌 0.2 mL チューブに 10,000 cpμ の 25 μL をアリコートし、適切に標識します。未使用のアリコートを-80°Cで保管してください。注: 合成 RNA は、分解を防ぐために -80 °C で保存する必要があります。 Hs_RPP30合成DNA(P1)を950 μLのヌクレアーゼフリー水に50 μLの原液を加えて200,000 cpμから10,000 cpμに希釈する。滅菌 0.2 mL チューブに 10,000 cpμ の 25 μL をアリコートし、適切に標識します。未使用のアリコートを-80°Cで保管してください。 960 μLのヌクレアーゼ非含有水にSARS-CoV-2ストックとHs_RPP30 10,000 cpμストックの両方を20 μL加え、合計1000 μLにして、各成分を終濃度200 cpμに希釈します。アリコートは、使用できる状態になるまで-80°Cで保管してください。 4. マスターミックスプレートの作製 注:合成SARS-CoV-2 RNAまたは患者検体から離れた滅菌環境でマスターミックスを作成します。すべての成分は、混合物に添加する前に完全に解凍されなければならない。適切な解凍を行わないと、濃度が正しくない可能性があります。不十分な解凍は、氷の存在または試薬の不均一な色によって示される。混合物を調製しながら冷凍庫ブロックに保管する。 マルチプレックスマスターミックス(総容量48mL、 表2)のバッチを50mL円錐管に調製する。 チューブを3倍に回して混合物を均質化します。上下にピペッティングしたり、ボルテックスをかけたりして混合すると酵素が損傷するため、混ぜないでください。 滅菌 96 ウェル深部ウェルリザーバーのカラム 1 ~ 4 を充填するには、1.48 mL のマスターミックスを各ウェルに移します。1つの50mL円錐形が4つのカラムを満たし、12プレートに十分です。 深い井戸リザーバをホイルシールで覆い、専用のマスターミックス液体処理ロボットに入れます。充填された深井戸リザーバをデッキ10に置き、6つの空の384ウェルプレートをデッキ1〜6に置き、P20チップボックスをデッキ11に配置します。深い井戸プレートとチップボックスを発見し、ロボットを閉じます。 カスタム Python 操作プロトコルを初期化するには、ロボットデスクトップアプリケーションで [実行の開始] をクリックします。 40 分後、実行は一時停止します。充填された384ウェルプレートをロボットに保持している間にホイルシールで覆い、ローラーで押し下げて接着性を確保します。各プレートの端にバッチ識別子のラベルを付けます。 6 つの新しい空の 384 ウェル プレートをデッキ 1 ~ 6 に配置し、[実行の再開] をクリックして操作プロトコル を再開します。ランが完了したら、384ウェルプレートの最終セットをホイルシールで覆います。 残りのマスターのピペット 2 μL を、バッチ品質管理用の空の 384 ウェルプレートのカラム 1 ~ 3 および 22 ~ 24 に混合します。光学的に透明なシールでシールし、サーモサイクラーで走ります(セクション10.1-10.2)。いずれかのウェルにN1閾値サイクル(Ct)値がある場合、または10を超えるウェルがP1 Ct値を有する場合、バッチは汚染されており、使用できません。 調製したマスターミックスプレートを4°Cで保管し、調製後7日以内に使用する。 5. サンプル採取、取水、熱処理 唾液採取の30分前に、食事、飲酒、喫煙、または歯科衛生の実施を避けるよう参加者に指示する。参加者に、口の中に自然に溜まる少なくとも1 mLの唾液を収集し、防腐剤を含まない滅菌50 mL円錐形チューブに堆積させ、チューブにキャップをするように指示する(補足ファイル3)。 唾液収集チューブの外側を70%エタノールまたは消毒用ワイプで除染し、検査室に移して試験します。 各サンプルバーコードをスキャンして、毎日の摂取スプレッドシート(補足ファイル4)にサンプルの到着を記録します。 スキャンしたサンプルを95°Cのオーブンで30分間熱処理します。耐熱手袋を着用したままサンプルを取り出します。注:未処理のサンプルは、室温(23°C)で最大72時間安定しています。熱処理後、サンプルはすぐに処理されない場合は、4°Cで保存する必要があります。 6. サンプル割当 サンプルアサインメントステーションのコンピューターで、各サンプルローディングロボット(補足ファイル5)の毎日のサンプルローディングスプレッドシートを開きます。 サンプル 1 ~ 48 は第 1 四半期、サンプル 49 ~ 96 は第 2 四半期、サンプル 97 ~ 144 は第 3 四半期、サンプル 145 ~ 188 は第 4 四半期と見なされます。サンプルは重複して分析されます。 プレート名、日付、および四半期番号が記載されたラベルトレイ。サンプルを順番にスキャンして、サンプル読み込みスプレッドシートに入れます。メモ: 図 3 で定義されているように、以前のプレートからのサンプルは手動で実行する必要があります。手動サンプルの割り当てとロード手順については、セクション 8.1 ~ 8.3 を参照してください。 7. サンプルローディングロボットの操作 サンプルローディングステーションでは、ロボットのデッキ配置に対応する8つの3Dプリントラックの2つのフルセットを並べます。 4分の 1 チューブのキャップを外し、ラック 1 の位置 A1 から始めて、3D プリントされたラックに入れます。各ラックを左から右、上から下まで満たします。このロード・パターンをラック 2 で続行してから、ラック 4 および 5 に進みます ( 図 2C を参照)。メモ: ラックには、ロボットプログラムパラメータの都合上、連続した番号が付けられていません。 ロードされたクォーター 1 サンプル・ラックをデッキ 1、2、4、5、7、8、10、11 に置きます。P20のヒントをデッキ3と9に置きます。セットアッププロセスを簡素化するには、材料を背面から前面までロボットにロードします。 4°Cから既製のマスターミックスプレートを取り出し、プレート名でラベルを付け、鋭利な刃を使用してコントロールウェル(N23/24、O23/24、およびP23/24)の周りのホイルの線を切断します。 マスターミックスプレートをデッキ6に置き、ホイルカバーを剥がして、コントロールウェルを覆う小さな長方形を残します。先端ボックスを発見し、ロボットを閉じます。 カスタム Python 操作プロトコルを初期化するには、ロボット デスクトップ アプリケーションで [実行の開始] をクリックします。各四半期はプレートに積み込むのに24.5分かかります。タイマーをリマインダーとして設定します。 ロボットの実行中に、セクション7.2で説明されているように、4分の1サンプルチューブのキャップを外して、3Dプリントされたラックの2番目のセットにロードします。 ロボットが一時停止したら、第 1 四半期ラックを取り外し、第 2 四半期ラックと交換します。デスクトップ・アプリケーションで 「実行の再開 」をクリックします。 4分の1サンプルチューブを要約し、結果を待っている間に4°Cの冷蔵庫に保管してください。この積載プロセスを第 3 四半期と第 4 四半期に繰り返します。 装填されたプレートをバイオセーフティキャビネットに移す。汚染を最小限に抑えるために、転写中はプレートを覆ったままにしてください。 8. 手動サンプルローディング メモ: ロボットの読み込みが不十分な場合は、繰り返しサンプルに対して 1 回の手動実行 (N1 Rerun または Rerun、 図 3 を参照) を実行します。 繰り返しサンプルを収集し、第4四半期の最後のサンプルとして割り当てます(セクション6.2を参照)。サンプルに番号を付け、バーコードをスキャンし、元のサンプルの場所と結果をサンプルローディングスプレッドシートに入力します。 繰り返しサンプルをバイオセーフティキャビネットに移します。繰り返しサンプルチューブをロボットローディングラックに積み込まないでください。 各反復サンプルのピペット2 μLをプレートレイアウト図(補足ファイル6)に従って正しいウェルに。患者サンプルを追加するには、指定されたピペットを使用してください。汚染を最小限に抑えるためにサンプルを追加しながら、ホイルで覆われた制御井戸を維持します。 9. テストプレートへのコントロールの追加 鉗子を使用して制御井戸の上のホイルカバーを剥がします。 N23-N24ウェルにヌクレアーゼフリー水(テンプレートコントロールなし)2 μLをピペットし、200 cpμ混合ポジティブコントロール(セクション3を参照)の2 μLをウェルO23-O24にピペットします。確認された陽性患者サンプルコントロールのピペット2 μLを、追加のコントロールとしてウェルM23−M24に入れた。ウェルP23-P24を空のままにして、マスターミックスバッチの品質を監視します。 プレートを光学的に透明なシールで覆い、アプリケーターローラーを使用してすべてのウェルにシールを接着します。プレートを2500rpmで30秒間渦巻き、徹底的に混合します。プレートを500 x g で1分間遠心分離します。 10. RT-qPCR の実行 サーモサイクラーソフトウェアで、記載された条件に従ってプロトコルプログラムを作成します(表3)。将来のプレートのためにプロトコルを保存します。密閉プレートをサーモサイクラーに置き、プロトコルを実行します。 Ct 値を .xslx ファイルとしてエクスポートし、その値をサンプル読み込みスプレッドシート (補足ファイル 5) にコピーします。メモ: これらのシートは、製造元のソフトウェアからの Ct 出力ファイル用にカスタム設計されており、他の形式を受け入れるために変更が必要な場合があります。 11. プレートの有効性の決定 陽性対照および/または既知の陽性サンプルと陰性対照の両方を検証して、プレートの結果を有効と見なします。以下の基準で対照ウェルを評価した。 陽性コントロールの場合は、少なくとも1つのポジティブコントロールウェル(O23/O24)がP1プローブとN1プローブの両方で22〜28のCt値を生成するかどうかを確認します。あるいは、既知の陽性サンプルウェル(M23/M24)は、P1およびN1プローブでP1およびN1 Ct値<33を生成します。 陰性対照の場合、2つの陰性対照ウェル(N23/N24)のいずれにもN1またはP1 Ct値がないことを確認してください。プレートを無効にする前に、Ct値に有効な増幅曲線があることを確認してください。 12. サンプル結果の解釈 図(図3)に従って患者の結果を決定し、解決されたサンプルを報告します。 P1 の結果を VALID または INVALID として評価します。P1 が Ct =33 の結果を生成する場合、または Ct 値がない場合、ウェルは無効であると考えてください。 N1 の結果を YES、NO、または NO* として評価します。N1 が Ct =33 を生成する場合、ウェルは NO* です。すべてのN1 Ct値が実際の増幅曲線に関連付けられていることを確認します。N1 の Ct 値に増幅曲線がない場合、ウェルは NO です。 繰り返しサンプルを識別し(N1再実行または再実行)、内部サンプル番号とサンプルタイプでラベルを付け、ローディングワークフローに返します(セクション8.1-8.3)。 13. 研究室の清掃 リキッドハンドリングロボット 中級レベルの消毒剤ですべての側面を清掃します。エタノールはプラスチックを劣化させるので使用しないでください。 ピペットチップの端とごみ箱をアルコール(70%エタノールまたは100%イソプロパノール)で優しく拭き取ります。キーボードとマウスを拭き取ります。 バイオセーフティキャビネット 中級レベルの消毒剤ですべての表面を清掃します。UVライトを15分間オンにします。