Местное применение Биоанализ для количественной оценки токсичности инсектицидов для комаров и плодовых мух
Summary
Мы описываем методологию и важность местного применения биоанализа для измерения восприимчивости к инсектицидам у комаров и плодовых мух. Представленный анализ является высокопроизводительным, использует массу насекомых, что позволяет рассчитать массу релятивизированной смертельной дозы вместо концентрации и, вероятно, имеет более низкую изменчивость, чем другие подобные методы.
Abstract
Продолжающееся использование инсектицидов для общественного здравоохранения и сельского хозяйства привело к широкому распространению устойчивости к инсектицидам и затруднению методов борьбы. Эпиднадзор за устойчивостью к инсектицидам популяций комаров обычно осуществляется с помощью центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC) бутылочных биоанализов или пробных тестов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ). Однако эти методы могут привести к высокой степени изменчивости данных о смертности из-за переменного контакта инсектицидов с насекомым, относительно небольшого числа протестированных организмов, обширных колебаний массы между популяциями и постоянно меняющихся условий окружающей среды, что приводит к переменным результатам. В этой статье представлен актуальный прикладной биоанализ, адаптированный в качестве высокопроизводительного фенотипического биоанализа как для комаров, так и для плодовых мух, для тестирования большого количества насекомых в диапазоне концентраций инсектицидов.
Этот анализ 1) обеспечивает постоянную обработку и контакт инсектицидов с каждым организмом, 2) дает высокоспецифичные кривые «доза-реакция», которые учитывают различия в средней массе между штаммами и полами (что особенно важно для организмов, собранных в полевых условиях), и 3) позволяет рассчитывать статистически строгие средние смертельные дозы (LD50). ), которые необходимы для сравнения соотношения резистентности – альтернативный подход к эпиднадзору за смертностью от диагностических доз, который также используется для эпиднадзора за устойчивостью к ларвицидам. Этот анализ будет дополнительным инструментом для точного фенотипирования популяций комаров и, как показано на примере плодовых мушек, легко адаптируется для использования с другими насекомыми. Мы утверждаем, что этот анализ поможет заполнить пробел между генотипической и фенотипической устойчивостью к инсектицидам у нескольких видов насекомых.
Introduction
Комары несут ответственность за более чем 700 000 смертей каждый год из-за болезней, которые они передают людям, причем более половины этих смертей вызваны только малярией1. Основным профилактическим методом против передачи малярии и других трансмиссивных болезней является использование инсектицидов, часто в форме инсектицидных сеток длительного пользования или остаточного распыления внутри помещений2. Однако устойчивость к инсектицидам широко распространена среди комаров и других насекомых-переносчиков, а также сельскохозяйственных вредителей 3,4. Для эффективного управления сопротивлением эпиднадзор имеет ключевое значение5. Для этого необходимы высокоточные и высокопроизводительные методы обнаружения сопротивления. В настоящее время наиболее распространенными инструментами эпиднадзора за устойчивостью комаров к инсектицидам являются тест6 в трубке ВОЗ и биоанализ из бутылок CDC7. Для плодовых мушек метод остаточного контактного применения (аналогичный биоанализу бутылки CDC) представляет собой широко используемый биоанализ инсектицидов 8,9,10. Тем не менее, вариабельность данных этих методов, как правило, высока, причем измерения одного и того же лабораторного штамма комаров варьируются от ~ 20-70% смертности в анализах бутылок CDC и 0-50% в пробных тестах ВОЗ при воздействии сублетальных доз11. Такая вариация удивительна, поскольку ожидается, что ограниченная генетическая изменчивость большинства лабораторных штаммов приведет к ограниченной изменчивости восприимчивости к инсектицидам в популяции. Тем не менее, по-прежнему наблюдается высокий уровень вариаций в результатах биоанализа.
Потенциальные источники этой изменчивости могут быть результатом гетерогенного воздействия инсектицидов между образцами в рамках биоанализа из-за косвенного воздействия инсектицидов через поверхность, гетерогенного воздействия окружающей среды, нормальной биологической изменчивости между особями одного и того же генотипа и изменения массы образцов одной и той же популяции12. . Редко используемым методом с более высокой воспроизводимостью является топический прикладной биоанализ. В этом анализе инсектицид наносится непосредственно на каждое насекомое13,14, устраняя фактор гетерогенного воздействия различных образцов в пределах одного и того же анализа. Однако из-за медленной пропускной способности этого метода он обычно не используется в качестве инструмента наблюдения за восприимчивостью к инсектицидам для популяций комаров. В данной работе представлен модифицированный протокол для местного применения биоанализа, который позволяет проводить воздействия с более высокой пропускной способностью, а также корректирует изменение массы насекомых, параметр, который коррелирует с изменениями восприимчивости к инсектицидам12. Снижение уровня шума и связанных с массой колебаний данных о смертности в результате переменного воздействия инсектицидов позволило бы обеспечить более точный технический эпиднадзор за устойчивостью 11,15. Такие данные могут быть использованы для более точного связывания фенотипической резистентности с генетическими маркерами, параметрами приспособленности и/или векторной компетентностью. Кроме того, мы демонстрируем, как этот анализ может быть легко адаптирован к другим видам насекомых, используя биоанализ местного применения на плодовых мухах, видах насекомых с меньшим телом.
Основным ограничением вышеупомянутых применений остаточного контакта является то, что воздействие инсектицидов может варьироваться от образца к образцу в пределах одного и того же анализа. В случае биоанализов в бутылках CDC и контактного метода воздействие инсектицидов может варьироваться между репликами одного и того же анализа. Насекомые подвергаются воздействию инсектицида, который либо распределяется на внутренней стороне стеклянной бутылки (метод биоанализа и контакта с бутылками CDC), либо на пропитанной бумаге (тест пробирки ВОЗ). Концентрация инсектицида на обеих поверхностях (стеклянной и бумажной) известна и предопределена путем скрининга различных видов известных генотипов. Однако количество, потенциально поглощаемое насекомым, может сильно варьироваться в зависимости от используемой поверхности, компонентов смеси инсектицидов и того, насколько однородно инсектицид распределен по поверхностному материалу16,17. В биоанализе бутылки CDC инсектицидное покрытие на внутренней стороне бутылки зависит от процедур, используемых каждой лабораторией и пользователем. В пробирке ВОЗ обработанные инсектицидами бумаги производятся централизованно и, таким образом, скорее всего, довольно однородны в разных лабораториях. Однако в пробке ВОЗ экспозиционная трубка позволяет образцам приземляться и опираться на металлическую сетку, не подвергающуюся воздействию инсектицидов, что приводит к потенциальному воздействию гетерогенных инсектицидов среди образцов в рамках каждого теста. Фактическое количество инсектицида, собранного и поглощенного образцами с помощью каждого метода, еще предстоит изучить18.
Кроме того, биоанализ бутылки CDC, тест ВОЗ в пробирке и контактный метод чаще всего используются в качестве пороговых анализов, проверяющих только одну заранее определенную концентрацию инсектицида. Этот подход может точно обнаружить наличие резистентности и полезен для наблюдения за устойчивостью (особенно когда устойчивость распространяется). Тем не менее, пороговые анализы не могут количественно оценить силу сопротивления, что может быть более прогностическим для эффективности инструментов вмешательства. Если с этими методами используются множественные концентрации инсектицидов, то они могут быть использованы в качестве анализов интенсивности. Анализ интенсивности для биоанализа в бутылке CDC и теста ВОЗ в пробирке был введен путем тестирования в 5 и 10 раз больше предопределенных дискриминирующих дозировок для устранения этого разрыва в эпиднадзоре 6,19. Обеспечивая большую способность дифференцировать резистентные популяции, 3-5 (предопределенные) дозы обеспечивают ограниченное разрешение для расчета летальных концентраций. Кроме того, в таких анализах используются комары различных размеров. Тем не менее, массу важно измерить, поскольку более крупным образцам может потребоваться более высокая доза для уничтожения, поскольку эффективная доза на единицу массы будет намного ниже, чем у меньшего организма12. Расчет релятивизированной массы смертельной дозы (количество инсектицида на массу насекомого) был бы более полезным показателем, чем более распространенная смертельная концентрация (например, количество инсектицида на площадь поверхности), поскольку он учитывает различия массы насекомых между полами, популяциями и генотипами. Такие данные помогут заполнить пробел между генотипической и фенотипической устойчивостью в лаборатории и на местах, а также могут обеспечить простой способ расчета необходимой концентрации для обработки популяции насекомых известной средней массы.
Использование массово-релятивизированных смертельных доз, которые убивают 50% образцов (LD50), также включает в себя несколько других преимуществ. Оценка токсичности конкретного соединения в мг/кг (= нг/мг) является стандартной в токсикологии человека и ветеринарии14, а значения LD50 указаны в паспортах безопасности материалов. Смертельные дозы также позволяют напрямую сравнивать токсичность различных химических веществ по отношению к определенному виду или одного и того же химического вещества к различным видам20, а также высококачественную оценку новых инсектицидов и химических веществ13. Кроме того, LD50 может обеспечить более значимые и точные соотношения резистентности, чем те, которые получены из результатов смертности от диагностических доз, что может привести к переоценке уровня резистентности, присутствующего в популяции. Таким образом, этот анализ будет подходить для рутинных программ эпиднадзора, обеспечивая более строгий мониторинг резистентности на основе массовых релятивизированных смертельных доз, полученных из большего количества образцов, чем рекомендовано для других биоанализов21.
Метод местного применения был использован в эпиднадзоре за восприимчивостью к инсектицидам у комаров и мух в качестве альтернативы стандартным биоанализам на восприимчивость к инсектицидам, когда устойчивость уже известна или подозревается22,23, а также для наблюдения за некоторыми насекомыми-вредителями24 для более точной оценки профилей устойчивости и внутренней токсичности инсектицидов21 . При местном применении биоанализа инсектицид наносится на каждый организм, что приводит к минимальным изменениям в воздействии инсектицидов. В настоящем документе представлен слегка адаптированный и улучшенный метод, который позволяет применять инсектицидное воздействие на большое количество насекомых в течение короткого периода времени, а также контролировать массу насекомых22. Этот высокопроизводительный метод с хорошими уровнями воспроизводимости может стать полезным дополнительным инструментом для рутинного эпиднадзора за восприимчивостью к инсектицидам.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье представлен адаптированный протокол для местного анализа применения комаров и плодовых мух. Эта процедура может быть легко адаптирована для использования в полевых условиях и с другими организмами, поскольку она требует минимального специализированного оборудования. Ниже рассматриваются критические шаги этого протокола, потенциальные изменения, советы по устранению неполадок, ограничения метода и значение этого метода.
Критические шаги в протоколе: В протоколе есть три критических шага, которые, если они заполнены неправильно, могут резко повлиять на результаты биоанализа: точность концентрации инсектицидов, нокдаун образца и оценка смертности.
Точность концентрации инсектицидов:
Чрезвычайно важно иметь точные растворы инсектицидов для получения воспроизводимых кривых «доза-реакция» и значимых результатов. Объемный подход к приготовлению раствора инсектицида более распространен в литературе как для биоанализа для бутылок CDC7, так и для местных применений 13,14,43. Однако гравиметрический подход, описанный здесь, по своей сути является более точным из-за учета температуры путем включения (температурно-специфической) плотности, что приводит к более точной подготовке состава.
Нокдаун образца:
Сбивание образцов является критическим компонентом этого метода и позволяет точно вводить инсектицид и измерять вес. Однако уничтожение организмов неизбежно содержит риск физического стресса и повреждения, как ранее продемонстрировано30. Поэтому будьте осторожны и внимательны при сбивании образцов, чтобы убедиться, что i) каждый экземпляр сбит в течение одинаковой продолжительности, ii) длина нокдауна сведена к минимуму и iii) метод нокдауна поддерживается последовательным для всех образцов. Кроме того, рекомендуется протестировать метод нокдауна отдельно, перед применением инсектицидов, чтобы убедиться, что метод является успешным и не вызывает контрольную смертность более 10%. Первоначальный тест может занять больше времени для неопытного пользователя, что приведет к увеличению времени нокдауна. Поэтому будьте осторожны при интерпретации результатов первых анализов.
Оценка смертности:
Оценка смертности может быть сложной задачей, особенно когда инсектицид не убивает полностью, а только сбивает с ног или калечит комара или муху. Поэтому важно знать, как инсектицид влияет на целевой организм, и иметь четкое определение «мертвых» (или сбитых) организмов перед началом. Кроме того, рекомендуется, чтобы один и тот же человек оценивал смертность между дозами и репликами, чтобы уменьшить вариации.
Изменения протокола: Несколько модификаций, описанных ниже, могут быть применены к этому протоколу для улучшения его универсальности и доступности.
Адаптация анализа к насекомым меньшего или большего размера:
При использовании меньших или более крупных образцов рекомендуется применять меньший или больший объем дозы инсектицида соответственно. Например, мы адаптировали протокол комаров к плодовым мухам, уменьшив дозу 0,5 мкл до дозы 0,2 мкл. Убедитесь, что выбран правильный размер шприца для выбранного объема дозы.
Адаптация анализа к полевым насекомым:
При использовании полевых насекомых может быть больше различий в размере насекомых. Поэтому взвешивание насекомых в меньших группах (например, на чашку) будет рекомендовано, а не как большая группа (например, все насекомые, используемые для одного эксперимента). Это может помочь уловить потенциальные вариации восприимчивости к инсектицидам, связанные с различиями в массе полевых насекомых.
Модификации оборудования:
Палатка для обработки насекомых: Дозирование образца может быть завершено под палаткой для обработки насекомых, которая просто построена из трубы из ПВХ и москитной сетки. Это может быть альтернативой закрытому помещению (например, инсектарному) и помочь устранить потенциальное загрязнение инсектицидами в районах, где может происходить выращивание насекомых. Эта палатка для обработки насекомых проста в строительстве и недорога (~ 70 долларов). В качестве альтернативы можно приобрести клетку для обработки насекомых (~ 425 долларов США).
Холодный стол: Пакеты со льдом или лотки со льдом могут быть использованы для сбивания образца и / или удержания образца в сбитом состоянии.
Инкубатор: Инкубаторы рекомендуются для выращивания образца и хранения образца в течение 24 ч после обработки инсектицидами. Если инкубатор недоступен, его можно построить. Оборудование, необходимое для строительства инкубатора, включает в себя изолированный контейнер, увлажнитель воздуха, тепловые кабели, регулятор влажности и температуры, а также свет, который должен составить общую стоимость ~ 170 долларов США, следуя и расширяя предыдущие методы44.
Хотя пластиковые стаканчики используются для сортировки и хранения обработанного образца, бумажные стаканчики с восковой подкладкой или стеклянные контейнеры будут подходящими альтернативами.
Модификация организма и стадии жизни:
Этот метод очень адаптируется для использования с другими переносчиками, насекомыми и / или членистоногими, такими как комары Culex quinquefasciatus 32, комнатные мухи32 и тараканы45, а также невзрачные стадии жизни, такие как личинки комаров46.
Изменение местоположения тематического приложения:
Этот метод описывает нанесение инсектицида на вентральную грудную клетку и область брюшка для комаров (и спинку для плодовых мушек). Тем не менее, другие места применения могут быть использованы, если место воздействия является согласованным. Консистенция важна, поскольку чувствительность к инсектицидам может варьироваться в зависимости от места применения32.
Советы по устранению неполадок: Этот метод имеет несколько шагов, которые изначально являются сложными. Ниже описаны некоторые из наиболее распространенных проблем, с которыми можно столкнуться.
Протекающие/испаряющиеся растворы инсектицидов:
Инсектициды обычно растворяются в ацетоне, высоколетутом соединении. Это означает, что ацетон быстро испаряется при комнатной температуре, увеличивая концентрацию инсектицидов с течением времени. Если растворы инсектицидов обнаруживают утечку или испарение, переделайте растворы, убедитесь, что крышка трубки плотно закреплена, и дважды проверьте, что протоколы хранения соблюдаются должным образом (например, используется парапленка, а трубки хранятся в вертикальном положении). Если утечка сохраняется, попробуйте заполнить трубки меньшим объемом, чтобы обеспечить больше места для изменения объема, которое ацетон испытывает при разных температурах. Кроме того, при использовании ацетона в качестве растворителя убедитесь, что трубки рассчитаны на хранение ацетона (например, пластмассы FEP, TFE и PFA). При использовании гидрофобных инсектицидов храните растворы в стеклянных флаконах (так как гидрофобные инсектициды прилипают к стеклу меньше, чем к пластику). Также рекомендуется маркировать мениск раствора перед хранением для контроля испарения.
Вес дрейфующих по микровесам при взвешивании организмов:
Если показания веса на весах дрейфуют (медленно поднимаются или опускаются), это может быть связано со статикой. Дрейф чаще всего происходит при взвешивании организмов в пластиковых предметах, так как пластик может легко удерживать статический заряд. Чтобы избежать этого, бумагу для взвешивания можно поместить под взвешиваемый пластиковый контейнер или использовать непластиковый контейнер, такой как стекло.
Результаты аномальной смертности:
Существует много способов, с помощью которых результаты смертности могут показаться ненормальными, например, наблюдение за высокой смертностью в контрольной группе или высокой/низкой смертностью во всех дозах инсектицидов. Рассмотрим следующие случаи устранения неполадок в каждом сценарии.
Высокий уровень контрольной смертности
Если в контрольной группе высокая смертность (10% и более), оцените метод нокдауна и продолжительность сбивания образцов. Если возможно, сократите продолжительность времени, в течение которого образцы сбиваются. Другие потенциальные факторы, которые следует учитывать для высокой смертности в контрольной группе, включают i) проверку правильности настроек инкубатора – аномальные температуры и / или влажность могут привести к увеличению смертности. Температура и влажность должны проверяться с помощью независимого регистратора данных. ii) Оценка обращения с насекомыми. Обращение с насекомыми слишком много или слишком грубо может привести к высокой смертности. iii) Проверка отсутствия инсектицидного загрязнения в 100% ацетоне, используемом для обработки контрольной группы или на приборах. Замените ацетон и очистите все инструменты ацетоном или этанолом. Избегайте загрязнения, часто заменяя перчатки, предотвращая просыпание и очищая инструменты. Обратите внимание, что в дополнительном файле 3 максимум два комара погибли в контрольных чашках (только для ацетона). Такой уровень смертности не считается высоким (он составляет менее 10%), а значит, поводов для беспокойства не было.
Высокая смертность во всех облученных группах (но не в контрольных группах)
Используйте более низкие концентрации инсектицидов или меньшие объемы доз для тестирования. Используемые дозы могут быть выше минимальной дозы, которая не будет вызывать смертность. Используйте несколько 10-кратных разведений, чтобы определить правильный диапазон доз и исключить загрязнение. Чтобы избежать загрязнения, начните дозировать с самой низкой концентрацией и работайте в направлении самой высокой концентрации. Кроме того, убедитесь, что все используемое оборудование регулярно очищается ацетоном и / или этанолом, дозы, применяемые к образцу, очень малы, и даже малейшее перекрестное загрязнение может повлиять на результаты.
Низкий уровень смертности во всех подверженных воздействию группах
Используйте более высокие концентрации инсектицидов. Используемые дозы могут быть слишком низкими, чтобы вызвать смертность среди населения. Чтобы определить правильный диапазон доз, подвергайте образцы еще нескольким 10-кратным концентрированным дозировкам. Убедитесь, что растворы инсектицидов не истекли и не разлагались (потенциально из-за высокой температуры или воздействия света). Если срок годности растворов истек или есть подозрения в их деградации, переделайте решения и обеспечьте соблюдение надлежащих условий хранения.
Непоследовательная смертность между репликами/днями
Время суток, когда насекомые подвергаются воздействию инсектицида, может влиять на уровень выраженной резистентности, особенно к метаболической резистентности34. Повторяйте этот протокол в течение одного и того же периода времени каждый день, чтобы избежать времени суток в качестве потенциальной переменной, способствующей изменениям смертности. Другие потенциальные факторы, способствующие непоследовательной смертности между репликами, включают i) образцы, дифференцированно выращенные между экспериментами. Убедитесь, что все образцы имеют одинаковый возрастной диапазон, выращиваются при одинаковой температуре и одинаковой плотности и доступности пищи. ii) концентрации инсектицидов, разлагающиеся с течением времени или становящиеся более концентрированными в результате испарения ацетона. Переделайте решения и обеспечьте надлежащие условия хранения. iii) Непоследовательная оценка смертности. Убедитесь, что один и тот же человек оценивает смертность или разработайте четкий протокол, который будет последовательно использоваться во всей команде. Используйте слепой балл, чтобы уменьшить предвзятость в оценке смертности.
Насекомые, прилипшие к поверхности сортировочного лотка:
Ацетон реагирует на пластмассы, используемые в этом протоколе, такие как чашки Петри. Образец, скорее всего, будет прилипать к поверхности, если использовать ацетон на чашках Петри или аналогичных пластиковых поверхностях. Этой адгезии можно избежать, выстилав сортировочный лоток бумагой для взвешивания или используя непластиковый сортировочный лоток. Кроме того, конденсация на поверхности пластика в сортировочном лотке или чашках для хранения может привести к тому, что насекомые прилипнут к конденсации, или образец может быть слишком холодным и потенциально замерзнуть на поверхности. Отрегулируйте метод нокдауна, чтобы уменьшить конденсацию, предотвращая при этом слишком холодное/замороженное изображение образцов (например, поместите бумагу для взвешивания между образцами и пластиковым сортировочным лотком).
Ошибки анализа R:
Как только данные о смертности собраны, во время анализа могут возникнуть различные осложнения. Наиболее распространенная причина, по которой код R не может выполнить действия для файла данных, заключается в том, что формат данных не соответствует коду (например, заголовки столбцов и/или пустые ячейки). Если возникают более серьезные осложнения, обратитесь к страницам справки R, встроенным в Rstudio35.
Ограничения вышеописанного метода местного применения:
Абсорбция инсектицидов методом местного применения не имитирует естественное воздействие:
Местное нанесение на первичный орган не является естественным путем всасывания инсектицидов. В полевых условиях насекомые в основном поглощают инсектициды через ноги в течение периода времени, в течение которого они контактируют с обработанной инсектицидами поверхностью или на крыльях через мелкие аэрозольные частицы 47,48, а не при быстром воздействии на вентральную поверхность. Однако прямое применение известной дозы инсектицидов позволит точно установить фенотипический ответ на инсектициды, необходимый для генетических и эволюционных исследований или сравнения восприимчивости к инсектицидам в пространстве или времени. Таким образом, этот подход полезен для тестирования технического сопротивления, но не будет непосредственно измерять практическое сопротивление (эффективность фактического инструмента вмешательства в полевых условиях15). Однако важно отметить, что нынешние стандартные методы (например, пробные тесты ВОЗ и биоанализы в бутылках CDC) также не могут захватывать или имитировать воздействие аэрозольных (т.е. путем запотевания) инсектицидов в полевых условиях.
Анализы местного применения могут оценить только контактные абсорбционные инсектициды:
Этот способ предназначен для инсектицидов, которые работают через контакт и поглощение инсектицида, а не для использования с оральными инсектицидами, такими как борная кислота, обычно используемая в привлекательных токсичных сахарных приманках49.
Значение метода:
Метод местного применения расширяет устоявшиеся стандарты для биоанализов инсектицидов путем расчета смертельной дозы (а не концентрации) и измерения технической (не практической) резистентности15. Ниже приведены преимущества и недостатки этого метода по сравнению с существующими анализами чувствительности к инсектицидам.
Расчет летальной дозы:
Этот метод определяет смертельную дозу инсектицида, а не смертельную концентрацию, которую биоанализы CDC и ВОЗ используют для установления дискриминирующей дозы11. Смертельная доза более значима, потому что это количественное количество инсектицида, которое, как известно, вызывает смертность. Напротив, смертельная концентрация не учитывает, сколько инсектицида организм фактически приобретает. При использовании расчета летальной дозы различия между профилями восприимчивости, зависящими от пола или размера, могут быть более точно наблюдаемыми и количественно оцененными, что делает это измерение еще более универсальным.
Техническое сопротивление:
Этот метод оценивает техническое сопротивление, которое представляет собой сопротивление, измеренное в стандартизированных контролируемых средах. Такие измерения подходят для наблюдения за распространением устойчивости к инсектицидам и связывания фенотипической резистентности с потенциальными маркерами15. Из-за снижения вариаций смертности в результате местного применения биоанализа он позволяет лучше идентифицировать новые маркеры резистентности. Однако из-за неестественного воздействия инсектицидов на комара этот анализ не подходит для оценки эффективности конкретного вмешательства в конкретной популяции. Другие анализы необходимы для измерения такого практического сопротивления15.
Адаптивность образца:
Этот метод может быть применен на других важных членистоногих, таких как вредители сельскохозяйственных культур (например, колорадский жук), домашние вредители (например, тараканы и постельные клопы) или опылители (например, пчелы) с простыми изменениями в подходе нокдауна и/или дозе инсектицида, объеме и/или концентрации (как описано выше). Легкость адаптации может помочь аналогить исследования устойчивости к инсектицидам в различных областях исследований. Использование значения LD50 вместо смертельной концентрации, которая убивает 50% образцов (LC50), позволяет проводить точное сравнение между видами.
Стоить:
Подобно биоанализам в бутылках CDC и пробным тестам ВОЗ, затраты на проведение анализа местного применения минимальны (см. Таблицу материалов). Основными элементами оборудования являются шприц (около 70 долларов США) и дозатор (около 100 долларов США), которые можно повторно использовать в анализах.
Количество необходимых образцов:
Минимум 20-25 образцов должны быть использованы на чашку для местного применения. Рекомендуется тестировать не менее пяти концентраций инсектицидов в каждом эксперименте, при этом для процедуры рекомендуется не менее трех реплик. В целом, это приводит к минимуму 300-375 образцов, необходимых для полного тестирования, что сопоставимо с количеством образцов, необходимых для выполнения тестов на интенсивность резистентности с использованием пробных тестов ВОЗ или биоанализов бутылок CDC. Однако, если снижение изменчивости достигается с помощью местного применения биоанализа, то такое же количество образцов может привести к большей статистической способности сравнивать данные о восприимчивости в пространстве или времени.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано премией CAREER Национального научного фонда SH под номером 2047572. Мы благодарим Дэмиена Риверу за его помощь в выращивании плодовой мухи и подготовке к местному анализу применения, доктора Ганецки из Университета Висконсин-Мэдисон за то, что он поделился своим штаммом плодовой мухи Кантон-S, Центры по контролю и профилактике заболеваний за совместное использование штамма Рокфеллера и Центр медицинской сельскохозяйственной и ветеринарной энтомологии Министерства сельского хозяйства США за совместное использование изолинового штамма IICC. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thomas Scientific | 20A00L068 | Acetone aliquot storage |
| 1.5 mL screw cap tubes | Thomas Scientific | 1182K23 | Insecticide dilution storage |
| 15 mL conical tubes | VWR | 339651 | Insecticide dilution storage |
| 20 mL glass scintillation vials | Fisher Scientific | 0334125D | Fruit fly weighing |
| 25 μL syringe | Fisher Scientific | 14815288 | Topical applicator |
| Acetone | Fisher Scientific | AC423240040 | ACS 99.6%, 4 L |
| Aedes aegypti (IICC strain) | USDA CMAVE | NA | Insecticide resistant |
| Aedes aegypti (Rockefeller strain) | CDC | NA | Insecticide susceptible |
| Analytical scale | Fisher Scientific | 14-557-409 | Precision up to 0.1 mg |
| Aspirator | Amazon | 6.49986E+11 | Mosquito collection device |
| Bench paper | VWR | 89126-794 | Place under workspace |
| Cotton swabs | Amazon | B092S8JVQN | Use for sorting insects |
| Cotton wool balls | Amazon | B0769MKZWT | Use for sucrose solution |
| Dispenser | Fisher Scientific | 1482225 | Repeater pipettor |
| Drosophila melanogaster (Canton-S strain) | University of Wisconsin-Madison | NA | Insecticide susceptible |
| Fine-tipped paint brushes | Amazon | B07KT2X1BK | Use for sorting insects |
| Fruit fly stock bottles | Fisher Scientific | AS355 | Use for rearing and sorting fruit flies |
| Hand-held CO2 dispenser | Fisher Scientific | NC1710679 | Use for knocking down insects |
| Holding cups | Amazon | B08DXG7V1S | Clear plastic |
| Ice pack | Amazon | B08QDWMMW5 | Use for knocking down fruit flies |
| Ice trays | Amazon | 9301085269 | Use for knocking down insects |
| Insect forceps | Amazon | B07B4767WR | Insect forceps |
| Insecticide | Sigma-Aldrich Inc | 45423-250MG | Deltamethrin |
| Labeling stickers | Amazon | B07Q4X9GWX | 3/4" Color dot stickers |
| Labeling tape | Amazon | B00X6A1GYK | White tape |
| Netting | Amazon | B07F2PHHWV | Use for covering holding cups and insect handling tent |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712H371 | 100 mm x 15 mm |
| PVC Pipe | Lowe’s | 23971 | Insect handling tent materials |
| Rubber bands | Amazon | B00006IBRU | Use for securing mesh/net on cups |
| Sucrose | Amazon | B01J78INO0 | Granulated White Sugar |
| Weighing paper | VWR | 12578-165 | 4" x 4" |
References
- World Health Organization. Vector-borne diseases. World Health Organization. , (2020).
- World Health Organization. Global plan for insecticide resistance management in malaria vectors. World Health Organization. , (2012).
- Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60 (1), 537-559 (2015).
- Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45 (1), 371-391 (2000).
- World Health Organization. Monitoring and managing insecticide resistance in Aedes mosquito populations. World Health Organization. , (2016).
- World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes (Second edition). World Health Organization. , (2016).
- McAllister, J. C., Scott, M. CONUS manual for evaluating insecticide resistance in mosquitoes using the CDC bottle bioassay kit. Centers for Disease Control and Prevention. , (2020).
- Duneau, D., et al. Signatures of insecticide selection in the genome of Drosophila melanogaster. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3469-3480 (2018).
- Pittendrigh, B., Reenan, R., ffrench-Constant, R. H., Ganetzky, B. Point mutations in the Drosophila sodium channel gene para associated with resistance to DDT and pyrethroid insecticides. Molecular & General Genetics: MGG. 256 (6), 602-610 (1997).
- Rinkevich, F. D., Du, Y., Dong, K. Diversity and convergence of sodium channel mutations involved in resistance to pyrethroids. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 93-100 (2013).
- Lissenden, N., et al. Review and meta-analysis of the evidence for choosing between specific pyrethroids for programmatic purposes. Insects. 12 (9), 826 (2021).
- Owusu, H. F., Chitnis, N., Müller, P. Insecticide susceptibility of Anopheles mosquitoes changes in response to variations in the larval environment. Scientific Reports. 7 (1), 3667 (2017).
- Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e57768 (2019).
- Burgess, E. R., King, B. H., Geden, C. J. Oral and topical insecticide response bioassays and associated statistical analyses used commonly in veterinary and medical entomology. Journal of Insect Science. 20 (6), 1-9 (2020).
- Namias, A., Jobe, N. B., Paaijmans, K. P., Huijben, S. The need for practical insecticide-resistance guidelines to effectively inform mosquito-borne disease control programs. eLife. 10 (1), 65655 (2021).
- Zhu, X., et al. Manipulating solid forms of contact insecticides for infectious disease prevention. Journal of the American Chemical Society. 141 (1), 16858-16864 (2019).
- Dang, K., Singham, G. V., Doggett, S. L., Lilly, D. G., Lee, C. Y. Effects of different surfaces and insecticide carriers on residual insecticide bioassays against bed bugs, Cimex spp. (Hemiptera: Cimicidae). Journal of Economic Entomology. 110 (2), 558-566 (2017).
- Spielmeyer, A., Schetelig, M. F., Etang, J. High-throughput analysis of insecticides on malaria vectors using liquid chromatography tandem mass spectrometry. PLoS ONE. 14 (2), 0211064 (2019).
- Bagi, J., et al. When a discriminating dose assay is not enough: measuring the intensity of insecticide resistance in malaria vectors. Malaria Journal. 14 (1), 210 (2015).
- Pridgeon, J. W., Becnel, J. J., Clark, G. G., Linthicum, K. J. Permethrin induces overexpression of multiple genes in Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology. 46 (3), 1-8 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications. World Health Organization. , (2009).
- Estep, A. S., et al. Quantification of permethrin resistance and kdr alleles in Florida strains of Aedes aegypti (L.) and Aedes albopictus (Skuse). PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (10), 0006544 (2018).
- Waits, C. M., et al. A comparative analysis of resistance testing methods in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) from St. Johns County, Florida. Florida Entomologist. 100 (3), 571-577 (2017).
- Kostromytska, O. S., Wu, S., Koppenhöfer, A. M. Diagnostic dose assays for the detection and monitoring of resistance in adults from Listronotus maculicollis (Coleoptera: Curculionidae) populations. Journal of Economic Entomology. 111 (5), 2329-2339 (2018).
- Aktar, W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Maïga, H., et al. Guidelines for routine colony maintenance of Aedes mosquito species. IAEA Physical and Chemical Sciences. , (2017).
- Gjullin, C. M., Hegarty, C. P., Bollen, W. B. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of aedes mosquito eggs. Journal of Cellular Physiology. 17 (2), 193-202 (1941).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420 (1), 27-44 (2008).
- Jass, A., Yerushalmi, G. Y., Davis, H. E., Donini, A., MacMillan, H. A. An impressive capacity for cold tolerance plasticity protects against ionoregulatory collapse in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 222 (1), 214056 (2019).
- Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., Vandenbrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Scientific Reports. 5 (1), 15298 (2015).
- Jung, Y., Kennedy, A., Chiu, H., Mohammad, F., Claridge-Chang, A., Anderson, D. J. Neurons that function within an integrator to promote a persistent behavioral state in Drosophila. Neuron. 105 (2), 322-333 (2020).
- Aldridge, R. L., Kaufman, P. E., Bloomquist, J. R., Gezan, S. A., Linthicum, K. J. Impact of topical application site on the efficacy of permethrin and malathion to Culex quinquefasciatus. Journal of the American Mosquito Control Association. 32 (4), 300-307 (2016).
- Rinkevich, F. D., et al. Distinct roles of the DmNav and DSC1 channels in the action of DDT and pyrethroids. Neuro Toxicology. 47 (1), 99-106 (2015).
- Balmert, N. J., Rund, S. S. C., Ghazi, J. P., Zhou, P., Duffield, G. E. Time-of-day specific changes in metabolic detoxification and insecticide resistance in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Journal of Insect Physiology. 64 (1), 30-39 (2014).
- R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. R Core Team. , (2021).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), 0146021 (2015).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of the American Mosquito Control Association. 3 (2), 302-303 (1987).
- Ravichandran, S. Data analysis through SAS with special emphasis on Probit analysis. National Academy of Agricultural Research Management (NAARM). , (2021).
- Smith, L. B., et al. CYP-mediated resistance and cross-resistance to pyrethroids and organophosphates in Aedes aegypti in the presence and absence of kdr. Pesticide Biochemistry and Physiology. 160 (1), 119-126 (2019).
- Finney, D. J. . Probit Analysis. , (1971).
- Silva, J. J., Kouam, C. N., Scott, J. G. Levels of cross-resistance to pyrethroids conferred by the Vssc knockdown resistance allele 410L+1016I+1534C in Aedes aegypti. PLOS Neglected Tropical Diseases. 15 (7), 0009549 (2021).
- Fan, Y., Scott, J. G. The F1534C voltage-sensitive sodium channel mutation confers 7- to 16-fold resistance to pyrethroid insecticides in Aedes aegypti. Pest Management Science. 76 (1), 2251-2259 (2020).
- Miller, A. L. E., Tindall, K., Leonard, B. R. Bioassays for monitoring insecticide resistance. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2129 (2010).
- Glunt, K. D., et al. Long-lasting insecticidal nets no longer effectively kill the highly resistant Anopheles funestus of southern Mozambique. Malaria Journal. 14 (1), 298 (2015).
- ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T., Roush, R. T., Tabashnik, B. E. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. , (1990).
- Akdag, K., et al. Synthesis and larvicidal and adult topical activity of some hydrazide-hydrazone derivatives against Aedes aegypti. Marmara Pharmaceutical Journal. 18 (1), 120-125 (2014).
- Richards, S. L., Byrd, B. D., Reiskind, M. H., White, A. V. Assessing insecticide resistance in adult mosquitoes: perspectives on current methods. Environmental Health Insights. 14 (1), (2020).
- Cooperband, M., Golden, F., Clark, G., Jany, W., Allan, S. Prallethrin-induced excitation increases contact between sprayed ultra-low volume droplets and flying mosquitoes (Diptera: Culicidae) in a wind tunnel. Journal of Medical Entomology. 47 (1), 1099-1106 (2010).
- Barbosa, D. S., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Evaluation of attractive toxic sugar baits (ATSB) against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in laboratory. Tropical Biomedicine. 36 (2), 578-586 (2019).
