الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي لتحديد سمية المبيدات الحشرية للبعوض وذباب الفاكهة
Summary
نحن نصف منهجية وأهمية الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي لقياس قابلية المبيدات الحشرية في البعوض وذباب الفاكهة. الفحص المقدم عالي الإنتاجية ، ويستخدم كتلة الحشرات – مما يسمح بحساب جرعة قاتلة نسبية الكتلة بدلا من التركيز – ومن المحتمل أن يكون له تباين أقل من الطرق المماثلة الأخرى.
Abstract
وقد أدى استمرار استخدام المبيدات الحشرية للصحة العامة والزراعة إلى انتشار مقاومة المبيدات الحشرية وإعاقة أساليب المكافحة. عادة ما يتم ترصد مقاومة المبيدات الحشرية لمجموعات البعوض من خلال المقايسات الحيوية لزجاجات مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC) أو اختبارات أنبوب منظمة الصحة العالمية (WHO). ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي هذه الطرق إلى درجة عالية من التباين في بيانات الوفيات بسبب الاتصال المتغير للمبيدات الحشرية بالحشرة ، والأعداد الصغيرة نسبيا من الكائنات الحية التي تم اختبارها ، والتباين الواسع النطاق في الكتلة بين السكان ، والظروف البيئية المتغيرة باستمرار ، مما يؤدي إلى نتائج متغيرة. تقدم هذه الورقة المقايسة الحيوية للتطبيق الموضعي ، والتي تم تكييفها كاختبار حيوي ظاهري عالي الإنتاجية لكل من البعوض وذباب الفاكهة ، لاختبار أعداد كبيرة من الحشرات على طول مجموعة من تركيزات المبيدات الحشرية.
يضمن هذا الفحص 1) العلاج المتسق واتصال المبيدات الحشرية مع كل كائن حي ، 2) ينتج منحنيات استجابة جرعة محددة للغاية تمثل الاختلافات في متوسط الكتلة بين السلالات والجنسين (وهو أمر مهم بشكل خاص للكائنات الحية التي تم جمعها ميدانيا) ، و 3) يسمح بحساب متوسط الجرعات المميتة الصارمة إحصائيا (LD50 )، وهي ضرورية لمقارنات نسبة المقاومة – نهج ترصد بديل من وفيات الجرعات التشخيصية، والذي يستخدم أيضا في ترصد مقاومة مبيدات اليرقات. سيكون هذا الفحص أداة تكميلية للتنميط الظاهري الدقيق لمجموعات البعوض ، وكما هو موضح باستخدام ذباب الفاكهة ، يمكن تكييفه بسهولة للاستخدام مع الحشرات الأخرى. نحن نجادل بأن هذا الفحص سيساعد في سد الفجوة بين مقاومة المبيدات الحشرية الجينية والمظهرية في أنواع الحشرات المتعددة.
Introduction
البعوض مسؤول عن أكثر من 700،000 حالة وفاة كل عام بسبب الأمراض التي ينقلها إلى البشر ، مع أكثر من نصف هذه الوفيات بسبب الملاريا وحدها1. والطريقة الوقائية الرئيسية ضد انتقال الملاريا وغيرها من الأمراض المنقولة بالنواقل هي استخدام المبيدات الحشرية، وغالبا ما تكون في شكل ناموسيات مبيدات حشرية طويلة الأمد أو رش داخلي متبقي2. ومع ذلك ، فإن مقاومة المبيدات الحشرية منتشرة على نطاق واسع بين البعوض وناقلات الحشرات الأخرى ، وكذلك الآفات الزراعية 3,4. ولإدارة المقاومة بفعالية، تكتسي المراقبة أهمية رئيسية5. لهذا ، هناك حاجة إلى طرق دقيقة للغاية وعالية الإنتاجية للكشف عن المقاومة. وفي الوقت الحالي، فإن أدوات مراقبة مقاومة المبيدات الحشرية الأكثر انتشارا بالنسبة للبعوض هي اختبار أنبوب منظمة الصحة العالمية6 والفحص الحيوي لزجاجة مركز السيطرة على الأمراض7. بالنسبة لذباب الفاكهة ، فإن طريقة تطبيق الاتصال المتبقي (على غرار الفحص الحيوي لزجاجة CDC) هي مقايسة بيولوجية شائعة الاستخدام للمبيدات الحشرية 8,9,10. ومع ذلك، فإن التباين في البيانات من هذه الطرق عادة ما يكون مرتفعا، حيث تتراوح قياسات نفس سلالة البعوض المختبري بين 20-70٪ تقريبا في اختبارات زجاجات CDC و 0-50٪ في اختبارات أنبوب منظمة الصحة العالمية عند التعرض لجرعات دون قاتلة11. هذا التباين مثير للدهشة لأن التباين الجيني المحدود في معظم سلالات المختبرات من المتوقع أن يؤدي إلى تباين محدود في قابلية المبيدات الحشرية بين السكان. ومع ذلك ، لا يزال هناك مستوى عال من التباين الذي لوحظ في نتائج الفحص البيولوجي.
ويمكن أن تكون المصادر المحتملة لهذا التباين نتيجة للتعرض غير المتجانس للمبيدات الحشرية بين العينات داخل المقايسة الحيوية بسبب التعرض غير المباشر للمبيدات الحشرية عبر السطح، والآثار البيئية غير المتجانسة، والتباين البيولوجي الطبيعي بين الأفراد من نفس النمط الوراثي، والتباين في كتلة العينات من نفس السكان12 . طريقة نادرة الاستخدام مع قابلية تكرار أعلى هي المقايسة الحيوية للتطبيق الموضعي. في هذا الفحص ، يتم تطبيق المبيد الحشري مباشرة على كل حشرة13,14 ، مما يزيل عامل التعرض غير المتجانس للعينات المختلفة داخل نفس المقايسة. ومع ذلك ، نظرا لطبيعة الإنتاجية البطيئة لهذه الطريقة ، لا يتم استخدامها بشكل روتيني كأداة لمراقبة قابلية المبيدات الحشرية لمجموعات البعوض. تقدم هذه الورقة بروتوكولا معدلا للفحص الحيوي للتطبيق الموضعي الذي يسمح بالتعرض لإنتاجية أعلى مع تصحيح التباين في كتلة الحشرات ، وهي معلمة ترتبط بالتغيرات في قابلية المبيدات الحشرية12. ومن شأن الحد من الضوضاء والتباين المرتبط بالكتلة في بيانات الوفيات الناجمة عن التعرض المتغير للمبيدات الحشرية أن يسمح بمراقبة المقاومة التقنية بدقة أكبر11,15. ويمكن استخدام هذه البيانات لربط مقاومة النمط الظاهري بدقة أكبر بالعلامات الجينية و/أو معلمات اللياقة البدنية و/أو كفاءة النواقل. بالإضافة إلى ذلك ، نوضح كيف يمكن بسهولة تكييف هذا الفحص مع أنواع الحشرات الأخرى باستخدام الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي على ذباب الفاكهة ، وهو نوع من الحشرات أصغر حجما.
القيد الرئيسي لتطبيقات الاتصال المتبقية المذكورة أعلاه هو أن التعرض للمبيدات الحشرية قد يختلف من عينة إلى أخرى ضمن نفس الفحص. في حالة المقايسات الحيوية لزجاجة CDC وطريقة الاتصال ، قد يختلف التعرض للمبيدات الحشرية بين النسخ المتماثلة لنفس المقايسة. تتعرض الحشرات لمبيد حشري يتم توزيعه إما داخل زجاجة زجاجية (الفحص الحيوي لزجاجة CDC وطريقة الاتصال) أو على الأوراق المشربة (اختبار أنبوب منظمة الصحة العالمية). تركيز المبيدات الحشرية على كلا السطحين (الزجاج والورق) معروف ومحدد مسبقا من خلال فحص أنواع مختلفة من الأنماط الوراثية المعروفة. ومع ذلك ، فإن الكمية المتاحة لاحتمال امتصاصها من قبل الحشرة يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا اعتمادا على السطح المستخدم ، ومكونات خليط المبيدات الحشرية ، وكيفية توزيع المبيد الحشري بشكل متجانس عبر المواد السطحية16,17. في الفحص الحيوي لزجاجة CDC ، يعتمد طلاء المبيدات الحشرية الموجود داخل الزجاجة على الإجراءات المستخدمة من قبل كل مختبر ومستخدم. في اختبار أنبوب منظمة الصحة العالمية ، يتم إنتاج الأوراق المعالجة بالمبيدات الحشرية مركزيا وبالتالي من المرجح أن تكون متجانسة تماما عبر المختبرات. ومع ذلك، في اختبار أنبوب منظمة الصحة العالمية، يسمح أنبوب التعرض للعينات بالهبوط والاستناد على شبكة معدنية غير معرضة للمبيدات الحشرية، مما يؤدي إلى احتمال التعرض للمبيدات الحشرية غير المتجانسة بين العينات داخل كل اختبار. ولا تزال الكمية الفعلية من المبيدات الحشرية التي تلتقطها العينات وتمتصها عبر كل طريقة بحاجة إلى مزيد من الاستكشاف18.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن المقايسة الحيوية لزجاجة CDC ، واختبار أنبوب منظمة الصحة العالمية ، وطريقة الاتصال هي الأكثر شيوعا كاختبارات عتبة تختبر تركيزا واحدا فقط من المبيدات الحشرية المحددة مسبقا. يمكن لهذا النهج أن يكتشف بدقة وجود المقاومة وهو ذو قيمة لمراقبة المقاومة (خاصة عندما تنتشر المقاومة). ومع ذلك، لا يمكن لاختبارات العتبة تحديد قوة المقاومة، والتي قد تكون أكثر تنبؤا بفعالية أدوات التدخل. إذا تم استخدام تركيزات مبيدات حشرية متعددة مع هذه الطرق ، فيمكن استخدامها كاختبارات كثافة. تم إدخال اختبارات الشدة للفحص الحيوي لزجاجة CDC واختبار أنبوب منظمة الصحة العالمية عن طريق اختبار 5x و 10x الجرعات التمييزية المحددة مسبقا لمعالجة هذه الفجوة في الترصد 6,19. في حين توفر قدرة أكبر على التمييز بين المجموعات السكانية المقاومة ، فإن 3-5 جرعات (محددة مسبقا) توفر دقة محدودة لحساب التركيزات المميتة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام البعوض من مختلف الأحجام في مثل هذه المقاييس. ومع ذلك ، من المهم قياس الكتلة لأن العينات الأكبر قد تحتاج إلى جرعة أعلى ليتم قتلها لأن الجرعة الفعالة لكل وحدة من الكتلة ستكون أقل بكثير من جرعة الكائن الحي الأصغر12. إن حساب جرعة قاتلة نسبية الكتلة (كمية المبيد الحشري لكل كتلة حشرة) سيكون مقياسا أكثر فائدة من التركيز المميت الأكثر شيوعا (على سبيل المثال ، كمية المبيد الحشري لكل مساحة سطحية) لأنه يأخذ في الاعتبار تباين كتلة الحشرات بين الجنسين والسكان والأنماط الوراثية. ومن شأن هذه البيانات أن تساعد على سد الفجوة بين مقاومة النمط الوراثي والنمط الظاهري داخل المختبر والميدان، ويمكن أن توفر أيضا طريقة سهلة لحساب تركيز التطبيق اللازم لعلاج مجموعة من الحشرات ذات الكتلة المتوسطة المعروفة.
استخدام جرعات قاتلة نسبية جماعية تقتل 50٪ من العينات (LD50) يتضمن أيضا العديد من الفوائد الأخرى. تقييم سمية مركب معين في مغ / كغ (= نانوغرام / ملغم) هو المعيار في علم السموم البشري والبيطري14 ، وتوجد قيم LD50 في صحائف بيانات سلامة المواد. تسمح الجرعات القاتلة أيضا بإجراء مقارنة مباشرة للسمية بين المواد الكيميائية المختلفة تجاه نوع معين أو نفس المادة الكيميائية تجاه الأنواع المختلفة20 ، بالإضافة إلى تقييم عالي الجودة للمبيدات الحشرية والمواد الكيميائية الجديدة13. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يوفر LD50 نسب مقاومة أكثر وضوحا ودقة من تلك المستمدة من نتائج وفيات الجرعة التشخيصية ، مما قد يؤدي إلى المبالغة في تقدير مستوى المقاومة الموجود في السكان. لذلك ، سيكون هذا الفحص مناسبا لبرامج المراقبة الروتينية من خلال توفير مراقبة مقاومة أكثر صرامة استنادا إلى جرعات قاتلة نسبية جماعية مشتقة من عينات أكثر مما هو موصى به للمقايسات الحيوية الأخرى21.
وقد استخدمت طريقة التطبيق الموضعية في ترصد قابلية البعوض والذباب لقابلية البعوض والذباب للمبيدات الحشرية كبديل للمقايسات البيولوجية القياسية لقابلية المبيدات الحشرية عندما تكون المقاومة معروفة بالفعل أو مشتبه فيها 22,23، وكذلك للترصد في بعض حشرات الآفات 24 لتقييم ملامح المقاومة والسمية الجوهرية للمبيدات الحشرية بدقة أكبر 21 . في الفحوصات الحيوية للتطبيق الموضعي ، يتم تطبيق المبيد الحشري على كل كائن حي ، مما يؤدي إلى الحد الأدنى من الاختلاف في التعرض للمبيدات الحشرية. تقدم هذه الورقة طريقة مكيفة ومحسنة قليلا تسمح بتطبيق التعرض للمبيدات الحشرية على عدد كبير من الحشرات في فترة قصيرة مع التحكم أيضا في كتلة الحشرات22. ويمكن أن تكون هذه الطريقة ذات الإنتاجية العالية مع مستويات جيدة من التكرار أداة إضافية مفيدة للترصد الروتيني لقابلية المبيدات الحشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه الورقة بروتوكولا معدلا لفحص التطبيق الموضعي للبعوض وذباب الفاكهة. ويمكن تكييف هذا الإجراء بسهولة لاستخدامه في الميدان ومع الكائنات الحية الأخرى لأنه يتطلب الحد الأدنى من المعدات المتخصصة. فيما يلي الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول ، والتعديلات المحتملة ، ونصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها ، وقيود الطريقة ، وأهمية هذه الطريقة.
الخطوات الحاسمة في البروتوكول: هناك ثلاث خطوات حاسمة في البروتوكول ، إذا تم إكمالها بشكل غير صحيح ، يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نتائج الفحص الحيوي: دقة تركيز المبيدات الحشرية ، وضربة قاضية للعينات ، وتقييم الوفيات.
دقة تركيز المبيدات الحشرية:
من المهم للغاية الحصول على حلول دقيقة للمبيدات الحشرية للحصول على منحنيات استجابة الجرعة القابلة للتكرار ونتائج ذات مغزى. النهج الحجمي لإعداد محلول المبيدات الحشرية هو أكثر شيوعا في الأدبيات لكل من المقايسة الحيوية لزجاجة CDC7 والتطبيقات الموضعية 13،14،43. ومع ذلك ، فإن نهج الجاذبية الموصوف هنا هو بطبيعته أكثر دقة بسبب النظر في درجة الحرارة من خلال تضمين كثافة (خاصة بدرجة الحرارة) ، مما يؤدي إلى إعداد صياغة أكثر دقة.
ضربة قاضية عينة:
يعد هدم العينات مكونا حاسما في هذه الطريقة ويسمح بالإدارة الدقيقة للمبيد الحشري وقياسات الوزن. ومع ذلك ، فإن هدم الكائنات الحية يحتوي حتما على خطر الإجهاد البدني والضرر ، كما هو موضح سابقا30. لذلك ، كن حذرا ويقظا عند هدم العينات لضمان i) يتم هدم كل عينة لفترة مماثلة ، ii) يتم الاحتفاظ بطول الضربة القاضية إلى الحد الأدنى ، و iii) يتم الحفاظ على طريقة الضربة القاضية متسقة عبر جميع العينات. بالإضافة إلى ذلك ، ينصح باختبار طريقة الضربة القاضية بشكل منفصل ، قبل استخدام المبيدات الحشرية ، للتأكد من نجاح الطريقة وعدم الحث على التحكم في الوفيات التي تزيد عن 10٪. قد يستغرق الاختبار الأولي وقتا أطول للمستخدم عديم الخبرة ، مما يؤدي إلى أوقات أطول للضربة القاضية. لذلك ، كن حذرا عند تفسير نتائج الفحوصات الأولى.
تقييم الوفيات:
يمكن أن يكون تقييم الوفيات أمرا صعبا ، خاصة عندما لا يقتل المبيد الحشري تماما ولكنه يهدم أو يشوه البعوضة أو الذبابة فقط. لذلك ، من المهم أن تكون على دراية بكيفية تأثير المبيد الحشري على الكائن الحي المستهدف وأن يكون لديك تعريف واضح للكائنات الحية “الميتة” (أو المحطمة) قبل البدء. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بأن يقوم نفس الشخص بتقييم الوفيات بين الجرعات والتكرارات لتقليل الاختلاف.
تعديلات البروتوكول: يمكن تطبيق العديد من التعديلات الموضحة أدناه على هذا البروتوكول لتحسين تنوعه وإمكانية الوصول إليه.
تكييف الفحص مع الحشرات الأصغر أو الأكبر حجما:
عند استخدام عينات أصغر أو أكبر ، ينصح بتطبيق كمية جرعة أصغر أو أكبر من المبيدات الحشرية ، على التوالي. على سبيل المثال ، قمنا بتكييف بروتوكول البعوض مع ذباب الفاكهة عن طريق تقليل جرعة 0.5 ميكرولتر إلى جرعة 0.2 ميكرولتر. تأكد من اختيار حجم المحقنة الصحيح لحجم الجرعة المختارة.
تكييف الفحص مع الحشرات الميدانية:
عند استخدام الحشرات الميدانية ، قد يكون هناك المزيد من الاختلاف في حجم الحشرات. لذلك ، يوصى بوزن الحشرات في مجموعات أصغر (على سبيل المثال ، لكل كوب) بدلا من وزنها كمجموعة كبيرة (على سبيل المثال ، جميع الحشرات المستخدمة في تجربة واحدة). هذا يمكن أن يساعد في التقاط التباين المحتمل في قابلية المبيدات الحشرية المرتبطة بالاختلافات في كتلة الحشرات الميدانية.
تعديلات المعدات:
خيمة مناولة الحشرات: يمكن إكمال جرعات العينة تحت خيمة مناولة الحشرات التي يتم بناؤها ببساطة باستخدام أنابيب PVC وشبكة البعوض. يمكن أن يكون هذا بديلا للغرفة المغلقة (على سبيل المثال ، الحشرية) ويساعد في القضاء على التلوث المحتمل بالمبيدات الحشرية في المناطق التي قد تحدث فيها تربية الحشرات. هذه الخيمة التي تتعامل مع الحشرات سهلة البناء ومنخفضة التكلفة (~ 70 دولارا). بدلا من ذلك ، يمكن شراء قفص مناولة الحشرات (~ 425 دولارا).
طاولة التبريد: يمكن استخدام أكياس الثلج أو صواني الثلج لهدم العينة و / أو الحفاظ على العينة مهدمة.
الحاضنة: يوصى باستخدام الحاضنات لتربية العينة والاحتفاظ بالعينة لمدة 24 ساعة بعد المعالجة بالمبيدات الحشرية. إذا لم تكن الحاضنة متوفرة ، فيمكن إنشاؤها. تشمل المعدات اللازمة لبناء الحاضنة حاوية معزولة ، ومرطب ، وكابلات حرارية ، ووحدة تحكم في الرطوبة ودرجة الحرارة ، وضوء ، والذي يجب أن يضيف ما يصل إلى تكلفة إجمالية تبلغ ~ 170 دولارا ، بعد الطرق السابقة44 والتوسع فيها.
حمل الكؤوس: على الرغم من أن الأكواب البلاستيكية تستخدم لفرز العينة المعالجة والاحتفاظ بها ، إلا أن الأكواب الورقية المبطنة بالشمع أو الحاويات الزجاجية ستكون بدائل مناسبة.
تعديل الكائن الحي ومرحلة الحياة:
هذه الطريقة قابلة للتكيف للغاية للاستخدام مع النواقل الأخرى والحشرات و / أو المفصليات مثل Culex quinquefasciatus mosquito 32 ، وذباب المنزل32 ، والصراصير45 ، وكذلك مراحل الحياة غير البالغة ، مثل يرقات البعوض46.
تعديل موقع التطبيق الموضعي:
تصف هذه الطريقة تطبيق المبيد الحشري على منطقة الصدر والبطن البطنية للبعوض (والظهرية لذباب الفاكهة). ومع ذلك، يمكن استخدام مواقع التطبيقات الأخرى طالما أن موقع التعرض متسق. الاتساق مهم لأن حساسية المبيدات الحشرية يمكن أن تختلف بناء على موقع التطبيق32.
نصيحة استكشاف الأخطاء وإصلاحها: تحتوي هذه الطريقة على العديد من الخطوات التي تمثل تحديا في البداية. فيما يلي بعض المشكلات الأكثر شيوعا التي قد يواجهها المرء.
تسرب / تبخير حلول المبيدات الحشرية:
عادة ما تذوب المبيدات الحشرية في الأسيتون ، وهو مركب شديد التقلب. وهذا يعني أن الأسيتون يتبخر بسرعة في درجة حرارة الغرفة، مما يزيد من تركيزات المبيدات الحشرية بمرور الوقت. إذا بدا أن محاليل المبيدات الحشرية تتسرب أو تتبخر ، فأعد تشكيل المحاليل ، وتأكد من أن غطاء الأنبوب قيد التشغيل بإحكام ، وتحقق مرة أخرى من اتباع بروتوكولات التخزين بشكل صحيح (على سبيل المثال ، يتم استخدام parafilm ، ويتم تخزين الأنابيب في وضع مستقيم). إذا استمر التسرب، فحاول ملء الأنابيب بحجم أقل للسماح بمساحة أكبر للتغيير في حجم الأسيتون الذي يختبره في درجات حرارة مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كنت تستخدم الأسيتون كمذيب ، فتأكد من تصنيف الأنابيب لتخزين الأسيتون (على سبيل المثال ، FEP و TFE و PFA البلاستيكية). في حالة استخدام مبيدات حشرية كارهة للماء ، قم بتخزين المحاليل في قوارير زجاجية (حيث تلتصق المبيدات الحشرية الكارهة للماء بالزجاج أقل من البلاستيك). من الممارسات الجيدة أيضا وضع علامة على الغضروف المفصلي للمحلول قبل التخزين لمراقبة التبخر.
انجراف الوزن على الميزان الدقيق عند وزن الكائنات الحية:
إذا كانت قراءة الوزن على الميزان تنجرف (ترتفع أو تنخفض ببطء) ، فقد يكون هذا بسبب الثبات. غالبا ما يحدث الانجراف عند وزن الكائنات الحية في العناصر البلاستيكية ، حيث يمكن للبلاستيك بسهولة الاحتفاظ بشحنة ثابتة. لتجنب ذلك ، يمكن وضع ورقة وزن أسفل الحاوية البلاستيكية التي يتم وزنها ، أو يمكن استخدام حاوية غير بلاستيكية مثل الزجاج.
نتائج الوفيات غير الطبيعية:
هناك العديد من الطرق التي قد تبدو بها نتائج الوفيات غير طبيعية ، مثل ملاحظة ارتفاع معدل الوفيات في الضوابط أو ارتفاع / انخفاض معدل الوفيات في جميع جرعات المبيدات الحشرية. راجع الحالات التالية لاستكشاف أخطاء كل سيناريو وإصلاحها.
ارتفاع معدل الوفيات السيطرة
إذا كان هناك معدل وفيات مرتفع في المجموعة الضابطة (10٪ أو أكثر) ، فقم بتقييم طريقة الضربة القاضية وطول الوقت الذي يتم فيه هدم العينات. إذا كان ذلك ممكنا ، قم بتقصير طول الفترة الزمنية التي يتم فيها هدم العينات. تشمل العوامل المحتملة الأخرى التي يجب مراعاتها لارتفاع معدل الوفيات في الضوابط i) التحقق مما إذا كانت إعدادات الحاضنة صحيحة – يمكن أن تؤدي درجات الحرارة و / أو الرطوبة غير الطبيعية إلى زيادة الوفيات. يجب التحقق من درجة الحرارة والرطوبة باستخدام مسجل بيانات مستقل. ب) تقييم التعامل مع الحشرات. يمكن أن يؤدي التعامل مع الحشرات أكثر من اللازم أو تقريبا إلى ارتفاع معدل الوفيات. iii) التحقق مما إذا كان لا يوجد تلوث بالمبيدات الحشرية في الأسيتون 100٪ المستخدم لعلاج المجموعة الضابطة أو على الأجهزة. استبدل الأسيتون ونظف جميع الأدوات بالأسيتون أو الإيثانول. تجنب التلوث عن طريق استبدال القفازات بشكل متكرر ومنع الانسكاب وأدوات التنظيف. لاحظ أنه في الملف التكميلي 3 ، مات اثنان كحد أقصى من البعوض داخل أكواب التحكم (الأسيتون فقط). لا يعتبر هذا المستوى من الوفيات مرتفعا (فهو أقل من 10٪) ، وبالتالي ، لم يكن هناك سبب للقلق.
ارتفاع معدل الوفيات في جميع المجموعات المعرضة (ولكن ليس في المجموعات الضابطة)
استخدم تركيزات أقل من المبيدات الحشرية أو كميات جرعات أصغر للاختبار. قد تكون الجرعات المستخدمة أعلى من الحد الأدنى للجرعة التي لن تحفز الوفيات. استخدم عدة تخفيفات 10 أضعاف لتحديد نطاق الجرعة الصحيح ، واستبعاد التلوث. لتجنب التلوث ، ابدأ الجرعات بأقل تركيز واعمل على تحقيق أعلى تركيز. بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من تنظيف جميع المعدات المستخدمة بانتظام باستخدام الأسيتون و / أو الإيثانول ، والجرعات المطبقة على العينة صغيرة جدا ، وحتى أدنى تلوث متقاطع يمكن أن يؤثر على النتائج.
انخفاض معدل الوفيات في جميع الفئات المعرضة
استخدام تركيزات أعلى من المبيدات الحشرية. قد تكون الجرعات المستخدمة منخفضة جدا بحيث لا تسبب وفيات بين السكان. لتحديد نطاق الجرعة الصحيح ، قم بتعريض العينات لعدة جرعات مركزة أكثر من 10 أضعاف. تأكد من أن محاليل المبيدات الحشرية لم تنته صلاحيتها أو تتحلل (ربما بسبب ارتفاع درجة الحرارة أو التعرض للضوء). إذا انتهت صلاحية المحاليل أو اشتبه في تدهورها، فأعد صياغة الحلول وتأكد من اتباع ظروف التخزين المناسبة.
معدل وفيات غير متسق بين التكرارات / الأيام
يمكن أن يؤثر الوقت من اليوم الذي تتعرض فيه الحشرات للمبيد الحشري على مستوى المقاومة المعبر عنها ، خاصة بالنسبة للمقاومة الأيضية34. كرر هذا البروتوكول خلال نفس الفترة الزمنية كل يوم لتجنب الوقت من اليوم كمتغير محتمل يساهم في التغيرات في معدل الوفيات. وتشمل العوامل المحتملة الأخرى التي تسهم في الوفيات غير المتسقة بين النسخ المتماثلة (أ) العينات التي يتم تربيتها بشكل تفاضلي بين التجارب. تأكد من أن جميع العينات من نفس الفئة العمرية ، وتربى في نفس درجة الحرارة وكثافة مماثلة وتوافر الغذاء. ب) تتحلل تركيزات المبيدات الحشرية بمرور الوقت أو تصبح أكثر تركيزا بسبب تبخر الأسيتون. أعد تصميم الحلول وتأكد من ظروف التخزين المناسبة. ج) تسجيل معدل وفيات غير متسق. تأكد من أن الشخص نفسه يسجل معدل الوفيات أو طور بروتوكولا واضحا لاستخدامه باستمرار عبر الفريق. استخدم الدرجات العمياء لتقليل التحيز في تسجيل الوفيات.
الحشرات الملتصقة بسطح صينية الفرز:
يتفاعل الأسيتون مع المواد البلاستيكية المستخدمة في هذا البروتوكول ، مثل أطباق Petri. من المرجح أن تلتصق العينة بالسطح إذا استخدمت الأسيتون على أطباق بتري أو الأسطح البلاستيكية المماثلة. يمكن تجنب هذا الالتصاق عن طريق بطانة درج الفرز بورق الوزن أو باستخدام صينية فرز غير بلاستيكية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي التكثيف على سطح البلاستيك في صينية الفرز أو حمل الأكواب إلى التصاق الحشرات بالتكثيف ، أو قد تكون العينة باردة جدا وربما تتجمد على السطح. اضبط طريقة الضربة القاضية لتقليل التكثيف مع منع العينات من أن تصبح باردة جدا / مجمدة (على سبيل المثال ، ضع ورق الوزن بين العينات ودرج الفرز البلاستيكي).
أخطاء تحليل R:
بمجرد جمع بيانات الوفيات ، قد تحدث مجموعة متنوعة من المضاعفات أثناء التحليل. السبب الأكثر شيوعا لعدم تمكن رمز R من إكمال الإجراءات الخاصة بملف البيانات هو أن تنسيق البيانات لا يتطابق مع التعليمة البرمجية (على سبيل المثال، عناوين الأعمدة و/أو الخلايا الفارغة). في حالة ظهور مضاعفات أكثر خطورة، ارجع إلى صفحات تعليمات R المضمنة في Rstudio35.
قيود طريقة التطبيق الموضعية الموضحة أعلاه:
امتصاص المبيدات الحشرية عن طريق طريقة التطبيق الموضعية لا يحاكي التعرض الطبيعي:
التطبيق الموضعي على الجسم الأساسي ليس الطريقة الطبيعية لامتصاص المبيدات الحشرية. في هذا المجال ، تمتص الحشرات في الغالب المبيدات الحشرية من خلال أرجلها على مدى طول الفترة الزمنية التي تكون فيها على اتصال بالسطح المعالج بالمبيدات الحشرية أو على أجنحتها من خلال جزيئات الهباء الجوي الصغيرة47,48 ، بدلا من التعرض السريع على السطح البطني. ومع ذلك، فإن التطبيق المباشر لجرعة معروفة من المبيدات الحشرية سيحدد بدقة استجابة النمط الظاهري للمبيدات الحشرية، اللازمة للدراسات الجينية والتطورية أو مقارنات قابلية المبيدات الحشرية عبر المكان أو الزمان. لذلك ، فإن هذا النهج مفيد لاختبار المقاومة التقنية ولكنه لن يقيس المقاومة العملية مباشرة (فعالية أداة التدخل الفعلية في الإعداد الميداني15). ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن الطرق القياسية الحالية (مثل اختبارات أنابيب منظمة الصحة العالمية والمقايسات الحيوية لزجاجات مراكز السيطرة على الأمراض) لا يمكنها أيضا التقاط أو محاكاة التعرض للمبيدات الحشرية في هذا المجال أو محاكاته.
يمكن لمقايسات التطبيق الموضعي تقييم المبيدات الحشرية لامتصاص الاتصال فقط:
هذه الطريقة مخصصة للمبيدات الحشرية التي تعمل من خلال ملامسة وامتصاص المبيد الحشري وليس للاستخدام مع المبيدات الحشرية الفموية ، مثل حمض البوريك المستخدم عادة في طعوم السكر السامة الجذابة49.
أهمية الطريقة:
تتوسع طريقة التطبيق الموضعية في المعايير الراسخة للمقايسات الحيوية للمبيدات الحشرية عن طريق حساب الجرعة القاتلة (وليس التركيز) وقياس المقاومة التقنية (غير العملية)15. فيما يلي مزايا وعيوب هذه الطريقة على اختبارات قابلية المبيدات الحشرية الحالية.
حساب الجرعة المميتة:
تحدد هذه الطريقة الجرعة القاتلة من المبيد الحشري ، بدلا من التركيز القاتل الذي تستخدمه المقايسات الحيوية لمراكز السيطرة على الأمراض ومنظمة الصحة العالمية لتحديد الجرعة التمييزية11. الجرعة القاتلة أكثر أهمية لأنها كمية كمية من المبيدات الحشرية المعروفة بأنها تسبب الوفيات. في المقابل ، لا يأخذ التركيز القاتل في الاعتبار مقدار المبيدات الحشرية التي يكتسبها الكائن الحي بالفعل. عند استخدام حساب الجرعة المميتة ، يمكن ملاحظة الاختلافات بين ملفات تعريف القابلية المعتمدة على الجنس أو الحجم بدقة أكبر وتحديدها كميا ، مما يجعل هذا القياس أكثر تنوعا.
المقاومة التقنية:
تقوم هذه الطريقة بتقييم المقاومة التقنية ، وهي المقاومة كما يتم قياسها في بيئات موحدة خاضعة للرقابة. وهذه القياسات مناسبة لمراقبة انتشار مقاومة المبيدات الحشرية وربط مقاومة النمط الظاهري بالعلامات المحتملة15. بسبب انخفاض التباين في الوفيات الناتج عن الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي ، فإنه يسمح بتحديد علامات المقاومة الجديدة بشكل أفضل. ومع ذلك ، بسبب التعرض غير الطبيعي للمبيدات الحشرية للبعوض ، فإن هذا الفحص غير مناسب لتقدير فعالية تدخل معين في مجموعة سكانية محددة. هناك حاجة إلى فحوصات أخرى لقياس هذه المقاومة العملية15.
القدرة على التكيف مع العينة:
يمكن ممارسة هذه الطريقة على المفصليات المهمة الأخرى مثل آفات المحاصيل (على سبيل المثال ، خنفساء البطاطس في كولورادو) ، أو الآفات المنزلية (على سبيل المثال ، الصراصير وبق الفراش) ، أو الملقحات (مثل النحل) مع تغييرات بسيطة على نهج الضربة القاضية و / أو جرعة المبيدات الحشرية وحجمها و / أو تركيزها (كما هو موضح أعلاه). يمكن أن تساعد سهولة القدرة على التكيف في تشبيه أبحاث مقاومة المبيدات الحشرية عبر مجالات البحث المختلفة. يتيح استخدام قيمة LD 50 بدلا من التركيز القاتل الذي يقتل 50٪ من العينات (LC50) مقارنة دقيقة بين الأنواع.
كلف:
على غرار المقايسات الحيوية لزجاجة CDC واختبارات أنبوب منظمة الصحة العالمية ، فإن تكاليف تشغيل فحص التطبيق الموضعي ضئيلة (انظر جدول المواد). القطع الأساسية من المعدات هي المحقنة (حوالي 70 دولارا) والموزع (حوالي 100 دولار) ، والتي يمكن إعادة استخدامها عبر المقاييس.
عدد العينات المطلوبة:
يجب استخدام ما لا يقل عن 20-25 عينة لكل كوب فحص تطبيقي موضعي. يوصى باختبار ما لا يقل عن خمسة تركيزات من المبيدات الحشرية لكل تجربة ، مع ما لا يقل عن ثلاثة تكرارات موصى بها لهذا الإجراء. وعموما، ينتج عن ذلك ما لا يقل عن 300-375 عينة مطلوبة لإجراء اختبار كامل، مقارنة بعدد العينات اللازمة لإجراء اختبارات شدة المقاومة باستخدام اختبارات أنبوب منظمة الصحة العالمية أو المقايسات الحيوية لزجاجات CDC. ومع ذلك ، إذا تم تحقيق انخفاض التباين باستخدام الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي ، فقد يؤدي نفس العدد من العينات إلى مزيد من القوة الإحصائية لمقارنة بيانات القابلية عبر المكان أو الزمان.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من خلال جائزة CAREER من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم إلى SH تحت رقم الجائزة 2047572. نشكر داميان ريفيرا على مساعدته في تربية ذبابة الفاكهة وإعدادها لفحص التطبيق الموضعي ، والدكتور غانيتسكي في جامعة ويسكونسن ماديسون على مشاركة سلالة ذبابة الفاكهة كانتون إس ، ومراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها لمشاركة سلالة روكفلر ، ومركز وزارة الزراعة الأمريكية للحشرات الطبية الزراعية والبيطرية لتقاسم سلالة أيزولين IICC. تم إنشاء الشكل 1 مع BioRender.com.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thomas Scientific | 20A00L068 | Acetone aliquot storage |
| 1.5 mL screw cap tubes | Thomas Scientific | 1182K23 | Insecticide dilution storage |
| 15 mL conical tubes | VWR | 339651 | Insecticide dilution storage |
| 20 mL glass scintillation vials | Fisher Scientific | 0334125D | Fruit fly weighing |
| 25 μL syringe | Fisher Scientific | 14815288 | Topical applicator |
| Acetone | Fisher Scientific | AC423240040 | ACS 99.6%, 4 L |
| Aedes aegypti (IICC strain) | USDA CMAVE | NA | Insecticide resistant |
| Aedes aegypti (Rockefeller strain) | CDC | NA | Insecticide susceptible |
| Analytical scale | Fisher Scientific | 14-557-409 | Precision up to 0.1 mg |
| Aspirator | Amazon | 6.49986E+11 | Mosquito collection device |
| Bench paper | VWR | 89126-794 | Place under workspace |
| Cotton swabs | Amazon | B092S8JVQN | Use for sorting insects |
| Cotton wool balls | Amazon | B0769MKZWT | Use for sucrose solution |
| Dispenser | Fisher Scientific | 1482225 | Repeater pipettor |
| Drosophila melanogaster (Canton-S strain) | University of Wisconsin-Madison | NA | Insecticide susceptible |
| Fine-tipped paint brushes | Amazon | B07KT2X1BK | Use for sorting insects |
| Fruit fly stock bottles | Fisher Scientific | AS355 | Use for rearing and sorting fruit flies |
| Hand-held CO2 dispenser | Fisher Scientific | NC1710679 | Use for knocking down insects |
| Holding cups | Amazon | B08DXG7V1S | Clear plastic |
| Ice pack | Amazon | B08QDWMMW5 | Use for knocking down fruit flies |
| Ice trays | Amazon | 9301085269 | Use for knocking down insects |
| Insect forceps | Amazon | B07B4767WR | Insect forceps |
| Insecticide | Sigma-Aldrich Inc | 45423-250MG | Deltamethrin |
| Labeling stickers | Amazon | B07Q4X9GWX | 3/4" Color dot stickers |
| Labeling tape | Amazon | B00X6A1GYK | White tape |
| Netting | Amazon | B07F2PHHWV | Use for covering holding cups and insect handling tent |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712H371 | 100 mm x 15 mm |
| PVC Pipe | Lowe’s | 23971 | Insect handling tent materials |
| Rubber bands | Amazon | B00006IBRU | Use for securing mesh/net on cups |
| Sucrose | Amazon | B01J78INO0 | Granulated White Sugar |
| Weighing paper | VWR | 12578-165 | 4" x 4" |
References
- World Health Organization. Vector-borne diseases. World Health Organization. , (2020).
- World Health Organization. Global plan for insecticide resistance management in malaria vectors. World Health Organization. , (2012).
- Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60 (1), 537-559 (2015).
- Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45 (1), 371-391 (2000).
- World Health Organization. Monitoring and managing insecticide resistance in Aedes mosquito populations. World Health Organization. , (2016).
- World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes (Second edition). World Health Organization. , (2016).
- McAllister, J. C., Scott, M. CONUS manual for evaluating insecticide resistance in mosquitoes using the CDC bottle bioassay kit. Centers for Disease Control and Prevention. , (2020).
- Duneau, D., et al. Signatures of insecticide selection in the genome of Drosophila melanogaster. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3469-3480 (2018).
- Pittendrigh, B., Reenan, R., ffrench-Constant, R. H., Ganetzky, B. Point mutations in the Drosophila sodium channel gene para associated with resistance to DDT and pyrethroid insecticides. Molecular & General Genetics: MGG. 256 (6), 602-610 (1997).
- Rinkevich, F. D., Du, Y., Dong, K. Diversity and convergence of sodium channel mutations involved in resistance to pyrethroids. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 93-100 (2013).
- Lissenden, N., et al. Review and meta-analysis of the evidence for choosing between specific pyrethroids for programmatic purposes. Insects. 12 (9), 826 (2021).
- Owusu, H. F., Chitnis, N., Müller, P. Insecticide susceptibility of Anopheles mosquitoes changes in response to variations in the larval environment. Scientific Reports. 7 (1), 3667 (2017).
- Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e57768 (2019).
- Burgess, E. R., King, B. H., Geden, C. J. Oral and topical insecticide response bioassays and associated statistical analyses used commonly in veterinary and medical entomology. Journal of Insect Science. 20 (6), 1-9 (2020).
- Namias, A., Jobe, N. B., Paaijmans, K. P., Huijben, S. The need for practical insecticide-resistance guidelines to effectively inform mosquito-borne disease control programs. eLife. 10 (1), 65655 (2021).
- Zhu, X., et al. Manipulating solid forms of contact insecticides for infectious disease prevention. Journal of the American Chemical Society. 141 (1), 16858-16864 (2019).
- Dang, K., Singham, G. V., Doggett, S. L., Lilly, D. G., Lee, C. Y. Effects of different surfaces and insecticide carriers on residual insecticide bioassays against bed bugs, Cimex spp. (Hemiptera: Cimicidae). Journal of Economic Entomology. 110 (2), 558-566 (2017).
- Spielmeyer, A., Schetelig, M. F., Etang, J. High-throughput analysis of insecticides on malaria vectors using liquid chromatography tandem mass spectrometry. PLoS ONE. 14 (2), 0211064 (2019).
- Bagi, J., et al. When a discriminating dose assay is not enough: measuring the intensity of insecticide resistance in malaria vectors. Malaria Journal. 14 (1), 210 (2015).
- Pridgeon, J. W., Becnel, J. J., Clark, G. G., Linthicum, K. J. Permethrin induces overexpression of multiple genes in Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology. 46 (3), 1-8 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications. World Health Organization. , (2009).
- Estep, A. S., et al. Quantification of permethrin resistance and kdr alleles in Florida strains of Aedes aegypti (L.) and Aedes albopictus (Skuse). PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (10), 0006544 (2018).
- Waits, C. M., et al. A comparative analysis of resistance testing methods in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) from St. Johns County, Florida. Florida Entomologist. 100 (3), 571-577 (2017).
- Kostromytska, O. S., Wu, S., Koppenhöfer, A. M. Diagnostic dose assays for the detection and monitoring of resistance in adults from Listronotus maculicollis (Coleoptera: Curculionidae) populations. Journal of Economic Entomology. 111 (5), 2329-2339 (2018).
- Aktar, W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Maïga, H., et al. Guidelines for routine colony maintenance of Aedes mosquito species. IAEA Physical and Chemical Sciences. , (2017).
- Gjullin, C. M., Hegarty, C. P., Bollen, W. B. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of aedes mosquito eggs. Journal of Cellular Physiology. 17 (2), 193-202 (1941).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420 (1), 27-44 (2008).
- Jass, A., Yerushalmi, G. Y., Davis, H. E., Donini, A., MacMillan, H. A. An impressive capacity for cold tolerance plasticity protects against ionoregulatory collapse in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 222 (1), 214056 (2019).
- Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., Vandenbrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Scientific Reports. 5 (1), 15298 (2015).
- Jung, Y., Kennedy, A., Chiu, H., Mohammad, F., Claridge-Chang, A., Anderson, D. J. Neurons that function within an integrator to promote a persistent behavioral state in Drosophila. Neuron. 105 (2), 322-333 (2020).
- Aldridge, R. L., Kaufman, P. E., Bloomquist, J. R., Gezan, S. A., Linthicum, K. J. Impact of topical application site on the efficacy of permethrin and malathion to Culex quinquefasciatus. Journal of the American Mosquito Control Association. 32 (4), 300-307 (2016).
- Rinkevich, F. D., et al. Distinct roles of the DmNav and DSC1 channels in the action of DDT and pyrethroids. Neuro Toxicology. 47 (1), 99-106 (2015).
- Balmert, N. J., Rund, S. S. C., Ghazi, J. P., Zhou, P., Duffield, G. E. Time-of-day specific changes in metabolic detoxification and insecticide resistance in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Journal of Insect Physiology. 64 (1), 30-39 (2014).
- R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. R Core Team. , (2021).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), 0146021 (2015).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of the American Mosquito Control Association. 3 (2), 302-303 (1987).
- Ravichandran, S. Data analysis through SAS with special emphasis on Probit analysis. National Academy of Agricultural Research Management (NAARM). , (2021).
- Smith, L. B., et al. CYP-mediated resistance and cross-resistance to pyrethroids and organophosphates in Aedes aegypti in the presence and absence of kdr. Pesticide Biochemistry and Physiology. 160 (1), 119-126 (2019).
- Finney, D. J. . Probit Analysis. , (1971).
- Silva, J. J., Kouam, C. N., Scott, J. G. Levels of cross-resistance to pyrethroids conferred by the Vssc knockdown resistance allele 410L+1016I+1534C in Aedes aegypti. PLOS Neglected Tropical Diseases. 15 (7), 0009549 (2021).
- Fan, Y., Scott, J. G. The F1534C voltage-sensitive sodium channel mutation confers 7- to 16-fold resistance to pyrethroid insecticides in Aedes aegypti. Pest Management Science. 76 (1), 2251-2259 (2020).
- Miller, A. L. E., Tindall, K., Leonard, B. R. Bioassays for monitoring insecticide resistance. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2129 (2010).
- Glunt, K. D., et al. Long-lasting insecticidal nets no longer effectively kill the highly resistant Anopheles funestus of southern Mozambique. Malaria Journal. 14 (1), 298 (2015).
- ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T., Roush, R. T., Tabashnik, B. E. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. , (1990).
- Akdag, K., et al. Synthesis and larvicidal and adult topical activity of some hydrazide-hydrazone derivatives against Aedes aegypti. Marmara Pharmaceutical Journal. 18 (1), 120-125 (2014).
- Richards, S. L., Byrd, B. D., Reiskind, M. H., White, A. V. Assessing insecticide resistance in adult mosquitoes: perspectives on current methods. Environmental Health Insights. 14 (1), (2020).
- Cooperband, M., Golden, F., Clark, G., Jany, W., Allan, S. Prallethrin-induced excitation increases contact between sprayed ultra-low volume droplets and flying mosquitoes (Diptera: Culicidae) in a wind tunnel. Journal of Medical Entomology. 47 (1), 1099-1106 (2010).
- Barbosa, D. S., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Evaluation of attractive toxic sugar baits (ATSB) against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in laboratory. Tropical Biomedicine. 36 (2), 578-586 (2019).
