인간 배반포 모델링 배반포 개발 및 이식을 위한 프로토콜

국제 줄기 세포 연구 협회 (ISSCR)의 줄기 세포 연구 및 임상 번역 지침은 인간 블라스토이드에 대한 연구가 전문 과학 및 윤리 검토 프로세스 3,4를 통해 검토 및 승인 된 후에 만 허용 될 것을 권장합니다. 모든 실험 절차는 오스트리아 과학 아카데미 (IMBA)의 분자 생명 공학 연구소 (Institute of Molecular Biotechnology)의 인간 연구 윤리위원회의 지침에 따라 Rivron_Stellungnahme_2020-04-22의 승인하에 수행되었습니다. 이러한 지침을 준수하는 것은 과학 저널에 연구 결과를 게시하는 데 필요합니다. 1. PXGL 조건에서 인간 나이브 배아줄기세포의 배양 참고 : Naive hPSC는 관련 실험실에서 얻을 수 있습니다. 여기에 사용 된 라인은 다카시마 야스히로 (현재 일본 교토의 CiRA에 있음)와 오스틴 스미스 (현재 영국 엑서 터 (Exeter)의 Living Systems Institute)의 실험실에서 얻은 것입니다. 대안적으로, 순진한 hPSC는 이전에 설명된 바와 같이 프라이밍된 hPSC들의 라인들로부터 사내에서 리셋될 수 있다(13,14). 순진한 hPSC는 여러 구절 (> 15)에 대해 안정적으로 나타나지만 배양의 품질은 시간이 지남에 따라 달라질 수 있습니다. 순진한 hPSC의 품질이 저하되면 세포의 새로운 바이알을 해동하거나 프라이밍 된 PSC에서 de novo naïve hPSC를 생성하십시오. 모든 배지 조성물에 대해서는 보충표 1을 참조한다. 조사된 마우스 배아 피더(MEFs)층의 제조 나이브 hPSCs의 계대 전날, 하기에 기재된 단계에 따라 조사된 MEF 층이 있는 6-웰 세포 배양 플레이트를 준비한다. 6-웰 세포 배양 플레이트를 웰 당 PBS 중의 0.1% 젤라틴 1 mL와 코팅한다. 플레이트를 30분 동안 37°C에서 인큐베이션한다. 젤라틴 용액을 제거하십시오. MEF 배지를 37°C에서 준비한다. MEFs를 작은 얼음 덩어리만이 남을 때까지 37°C의 수조에서 해동시킨다. 바이알의 부피를 P1000 피펫을 사용하여 제조된 MEF 배지 1 mL와 함께 용해시킨다. 세포 현탁액을 15 mL 튜브 내로 옮긴다. 서스펜션을 200 x g 에서 4 분 동안 회전시킵니다. 상청액을 흡인하고, 신선한 MEF 배지를 첨가하여 MEF 펠릿을 재현탁시킨다(웰 당 1.5 mL에 충분함). 세포 계수 슬라이드를 사용하여 세포를 계수하고 웰 당 300,000 개의 세포를 추가하고 플레이트를 37 °C의 normoxy 인큐베이터로 옮깁니다.참고: 시간이 지남에 따라 MEF가 분리되면 일상적인 미디어 변경 중에 새 MEF를 PXGL 매체에 추가할 수 있습니다. 인간 순진한 만능 줄기 세포의 계대노화 hPSC를 통과하기 전에 현미경으로 형태를 확인하십시오. 식민지는 일반적으로 밝고 정의 된 경계가있는 돔 모양의 형태를 가지고 있습니다. 개별 콜로니가 평평한 형태를 나타내거나 분화 된 식민지가 나타나기 시작하면 1.2.8 단계의 지침을 따르십시오. 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 한 번 세척한다. 6-웰 플레이트의 웰 당 500 μL의 세포 분리 용액을 첨가한다. 세포를 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다. P1000 피펫과 피펫을 사용하여 세포를 여러 번 사용하여 콜로니를 단일 세포로 해리시킵니다. 세포를 수집하고 세척 완충액(6-웰 플레이트의 웰당 1 mL)이 들어있는 15 mL 튜브 내로 옮긴다. 세포를 4 분 동안 200 x g 에서 회전시킵니다. 상청액을 흡인하고, 펠렛을 신선한 PXGL 배지에 재현탁시킨다(웰 당 1.5 mL에 충분함). 일상적으로 패시징을 위해 1:3-1:6의 분할 비율을 고려하십시오.참고: 매 3-4 계대 후 또는 세포 형태학에 따라 세포 배양의 질이 감소하는 경우 (예를 들어, 집단에서 편평한 콜로니의 출현), 10 μM Y-27632 및 성장 인자 기저막 추출물 (5 μL/웰)을 패시징 후 처음 24 h 동안 배지에 첨가한다. hPSCs를 재도금하기 전에, MEF 배지를 흡인하고 PBS로 한 번 세포를 세척함으로써 신선한 MEF로 플레이트를 준비한다. 이어서, P1000 피펫을 사용하여 MEFs를 함유하는 6-웰 플레이트의 웰 당 1.5 mL의 hPSCs 세포 현탁액을 옮긴다.참고: 피펫팅이 웰 영역을 가로질러 세포의 균질한 시딩으로 이어지는지 확인하십시오. 이것은 균질 한 크기와 세포의 상대적 동시성을 가진 콜로니의 성장을 보장 할 것입니다. hPSCs를 가습된 환경에서 37°C에서 저산소 조건 하에서 배양한다. 24시간 후에는 hPSC를 부착해야 합니다. 많은 수의 비 부착성 (또는 부유하는) 세포는 생존 가능성 또는 통과 시 부착의 문제를 반영합니다. 매일 웰 당 1.5 mL의 PXGL 배지로 배지를 교체하십시오. hPSC를 3-4 일마다 통과하거나 블라스토이드 형성 실험에 사용하십시오.참고 : hPSC를 해동 한 후 블라스토이드 실험을 시작하기 전에 최소 세 개의 통로를 통과하십시오. 2. 블라스토이드의 형성 순진한 PSC 응집체의 형성 실험을 시작하기 전에 PXGL 배지, N2B27 기본 배지, 세척 완충액, PBS 및 응집 배지를 준비하고 미리 가온한다. 아래에 설명된 단계에 따라 블라스토이드를 형성하기 위한 hPSCs 현탁액으로부터 MEF를 배제한다. MEF 배제를 위해, 6-웰 플레이트의 웰에 0.1% 젤라틴 1 mL를 첨가하고, 37°C에서 30-90분 동안 인큐베이션함으로써 젤라틴 코팅된 플레이트를 제조하였다. 세포를 수확하기 위해, 배지를 흡인하고 세포를 PBS 1 mL로 세척한다. 500 μL의 세포 분리 용액(6-웰 플레이트의 웰 당)을 첨가하고, 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다. 현미경으로 세포를 확인하여 콜로니를 단일 세포로 해리 한 다음 (몇 개의 다세포 덩어리는 나중에 부드러운 피펫팅에 의해 해리 될 수 있음). 세포 분리 용액을 1 mL의 세척 완충액으로 희석하십시오. 5 내지 10회 부드럽게 피펫팅하여 플레이트로부터 세포를 수집한다. 세포 현탁액을 15 mL 튜브 내로 옮긴다. 세포를 4 분 동안 200 x g 에서 회전시킵니다. 상청액을 흡인하고, 세포를 1.5 mL의 PXGL 배지 (6-웰 플레이트의 웰 당)에 재현탁시키고, MEF 배제를 위해 젤라틴 코팅된 플레이트 상에 세포를 시드하고, 37°C에서 60-90분 동안 인큐베이션한다. 일단 나이브 세포가 MEF 배제를 위해 시딩되면, 마이크로웰로부터 PBS를 제거하고, 웰을 200 μL의 기저 N2B27 배지 (1 마이크로웰 칩 당)로 평형화시키고, 37°C에서 60분 동안 인큐베이션한다. 부착되지 않은 나이브 세포를 함유하는 상청액을 수집하고, 이를 15 mL 튜브로 옮기고, 세포를 200 x g 에서 4분 동안 스핀다운시킨다. 배지를 흡인하고 세포를 1 mL의 N2B27 기저 배지에 재현탁시킨다. 셀 카운팅 슬라이드를 사용하여 셀 카운트를 계산합니다. 세포를 4 분 동안 200 x g 에서 회전시킵니다. 배지를 흡인하고 N2B27 배지에 포함된 10 μM Y-27632의 적량을 첨가하여 50 μL 당 30,000 세포의 세포 밀도를 얻었다.참고: 최적의 초기 시딩 세포 수는 상이한 세포주에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 50-60 세포/마이크로웰을 시드하기 위해, 30,000개의 세포(일부 세포가 마이크로웰 외부에 떨어지는 것을 고려한 잉여 포함)는 430개의 마이크로웰을 포함하는 96웰 플레이트의 1웰에 시딩된다. 부적절한 시작 세포 수는 공동없이 작은 응집체 형성 또는 250 μm 이상에 도달하는 캐비테이션 구조의 형성을 초래할 수 있습니다. 평형화된 마이크로웰 어레이로부터 배지를 흡인하고, 25μL의 N2B27 배지를 10μM Y-27632로 첨가한다. 50 μL의 세포 현탁액을 첨가하고, 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다(세포가 마이크로웰의 바닥으로 떨어질 때까지). 이어서, 10 μM Y-27632로 보충된 N2B27 배지 125 μL를 첨가한다. 블라스토이드 개발 24시간 이내에, 순진한 hPSC의 응집체가 마이크로웰 칩 상에서 관찰될 수 있다(제0일). 블라스토이드 형성을 시작하려면 PALLY 배지를 준비하고 아래에 설명 된 단계를 따르십시오. PALLY 배지를 37°C에서 30분 동안 예열한다.참고: 1-올레오일 리소포스파티드산(LPA) 및 10μM Y-27632는 사용 직전에 첨가해야 합니다. LPA의 최적 농도는 0.5-5 μM 사이에서 변화한다. 이것은 블라스토이드에 사용되는 개별 hPSC 라인에 대해 적정되어야합니다. 응집 배지를 흡인한다. 200 μL의 미리 가온된 PALLY 배지를 마이크로웰에 첨가한다. 세포 배양 플레이트를 다시 저산소 인큐베이터에 넣고 37°C에서 한다. 1일째에 미디어 변경을 반복합니다. 2일째에, PALLY 배지를 제거하고 LPA 및 10 μM Y-27632로 보충된 N2B27 배지 200 μL를 첨가한다.참고 : 2 일째에는 대부분의 집계가 계속 증가하고 있습니다. 그러나 일부 응집체는 작은 충치를 형성합니다. 블라스토이드를 4일째까지 PALLY 또는 2일째부터 시험관내 배양 배지(IVC1)에서 지속적으로 배양한다. 그러나, 이러한 배지 변화에 따라 성숙한 블라스토이드에서 PrE의 형성이 향상된다. 3 일째에 미디어 변경을 반복하십시오. 완전한 블라스토이드 형성은 4 일째까지 발생합니다.참고: 블라스토이드는 7일째 인간 배반포(예를 들어, 직경 범위가 150-250 μm, 트로피코배엽 유사 세포의 상피로 둘러싸인 하나의 내부 클러스터)의 형태 측정에 기초한 완전한 형태형성을 거쳤을 때 완전히 발달한 것으로 간주되며, 극성 영양 결핍 유사 세포(NR2F2+/CDX2-) 및 PrE 유사 세포(GATA4+)를 형성하였다. 이는 면역형광 염색 또는 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 평가할 수 있다. 3. 96 웰 초저 부착 마이크로 플레이트에서 블라스토이드 형성 2.1.1 – 2.1.11에서 상기 기재된 단계에 따라 블라스토이드 형성을 위한 나이브 hPSCs 세포 현탁액을 제조한다. 배지를 흡인하고 10 μM Y-27632를 함유하는 적절한 양의 N2B27 배지를 첨가하여 배지 100 μL 당 70 세포의 세포 밀도를 얻었다.참고: 최적의 초기 시딩 세포 수는 상이한 세포주에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 70 세포/웰은 대부분의 세포주에 대한 최적의 세포 수일 수 있다. 플레이트를 실온에서 2분 동안 200 x g 에서 원심분리하여 웰의 바닥에 세포를 클러스터링한다. 플레이트를 저산소 배양 조건 하에서 37°C의 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 24 시간 이내에 순진한 hPSC의 응집체가 우물에서 관찰 될 수 있습니다 (0 일째). 2x PALLY 배지를 준비하십시오. 100 μL의 예열된 2x PALLY 배지를 웰에 첨가한다. 세포 배양 플레이트를 다시 37°C의 저산소 인큐베이터에 놓는다. 24시간 후, 배지의 절반(100 μL)을 흡인하고, 이를 100 μL의 예열된 PALLY 배지로 교체한다. 4 일째까지 단계를 반복하십시오. 골재를 흡인하지 않도록하십시오.참고: 2일째에는 대부분의 집계가 계속 증가하고 있습니다. 그러나 일부 골재에는 작은 액체로 채워진 충치가 있습니다. 4 일째에, 캐비테이션 된 구조물의 대부분은 배반포 유사 구조를 형성하기 위해 완전한 형태 형성을 겪습니다. 4. 트로피권의 형성 트로피권 형성을 위해, 단계 2.1.1 (MEF 배제)으로부터 단계 2.1.12 (시딩 프로토콜의 마지막 단계)까지 블라스토이드 형성 프로토콜을 따른다. 일단 순진한 hPSCs의 응집체가 24시간 후에 형성되면, 응집 배지를 초기 영양 영양증을 나타내는 트로피권의 형성을 위해 3 μM SC-144로 보충된 PALY(LIF 없이)로 교환하고, 성숙한 영양 영양배를 나타내는 트로피권의 형성을 위해 2 μM XMU-MP-1로 보충된 PLI로 교환한다. 매일 매체를 새로 고칩니다. 완전한 트로피권 형성은 4 일째까지 발생합니다. 5. scRNAseq 를 이용한 블라스토이드 세포 상태 및 이의 반사 단계 분석 블라스토이드를 집어 들고 해리를 수행하려면, 진탕 인큐베이터를 37°C로 예열하고 100 rpm으로 설정한다. 초기 96-웰 플레이트에서 블라스토이드를 수집하고 유리 모세관이 장착된 입 피펫을 사용하여 U-bottom 96-웰 플레이트의 여러 웰로 옮깁니다.참고: 블라스토이드(> 70%)는 비블라스토이드 구조(< 30%)로 오염되는 것을 피하기 위해 형태측정 기준(크기 = 고유한 내부 클러스터가 있는 150-250μm)에 따라 선택되어야 합니다. P200을 사용하여 200 μL의 PBS로 한 번 세척하여 입체현미경으로 관찰하였다. 50 μL의 콜라게나제를 함유하는 웰로 옮기고, 진탕 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이션한다. 블라스토이드를 10x 트립신-EDTA의 100 μL로 웰로 옮기고 잘 섞는다. 진탕 인큐베이터에서 20분 동안 인큐베이션한다. P200 피펫을 사용하여 블라스토이드를 단일 세포로 해리시킵니다. 세포를 FACS 완충액 (PBS 중 1% FBS)이 있는 15 mL 튜브 내로 옮긴다. 세 계통의 유사체의 특이적 비율을 포착하기 위해, TE 및 PrE 유사체를 각각 TROP2 및 PDGFRa 항체로 염색한다.참고 : 인간 배반포의 PrE 세포 수는 마우스 배반포에 비해 적으며, 이는 시험관 내 수정 (IVF) 또는 종 차이를 통해 형성된 배반포의 발달 결함을 반영 할 수 있습니다. 블라스토이드에서, PrE 유사체는 TE 및 EPI 유사체보다 덜 풍부하며, 면역형광 영상화에 의한 GATA4+ 세포의 계수시 세포의 7.4%를 나타낸다. 또한, 해리 과정은 블라스토이드 해리, PDGFRa 태깅 및, FACS 분석시 세포의 1%-2%를 나타내는 PrE 유사체로서 상이한 세포 유형의 비율에서 바이어스를 유도할 수 있다. FACS-정렬된 세포는 세 개의 계보 유사체 모두로부터 smart-seq2 분석을 위한 용해 완충액을 함유하는 384-플레이트로 분류된다. DAPI 염색으로 표시된 죽은 세포를 배제하십시오 (제조업체의 지침에 따라 수행). 세포 상태 (세포 유형 및 발달 단계)를 평가하기 위해, 블라스토이드로부터의 전사체 데이터를 적절한 대조군과 비교한다. 6. 블라스토이드 발달 진행을 평가하기 위한 확장된 배양 인간 블라스토이드를 기저막 매트릭스 코팅 플레이트 (유리 바닥)에 배양하십시오. 플레이트를 기저 멤브레인 매트릭스로 코팅하십시오. 모폴로이드를 육안으로 검사하여 형태를 평가하고 기록합니다.참고 : 컴팩트 한 ICM을 가진 고전적인 중공 볼 배반포 형태를 보여주는 블라스토이드 만이 더 성장하고 발전 할 잠재력이 있습니다. 96-웰 플레이트의 1웰 당 100 μL의 CMRL 배지-1을 첨가하고, 평형화를 위해 블라스토이드 이송 전에 적어도 2 h 전에 플레이트를 인큐베이터에 배치한다. 입체현미경을 사용하여, 양호한 형태를 갖는 블라스토이드를 시각적으로 확인하고, 선택된 블라스토이드를 100 μl의 CMRL 배지-1을 함유하는 96-웰 플레이트의 웰에 전달하여 블라스토이드 매질의 흔적을 제거하였다. 블라스토이드를 미리 평형화된 CMRL 매질-1을 함유하는 웰 내로 옮긴다. 플레이트를 인큐베이터에 놓고 하룻밤 동안 37°C에서 인큐베이션한다.참고: 최대 5개의 블라스토이드를 96웰 플레이트의 한 웰에서 배양할 수 있습니다. 단일 웰에 너무 많은 블라스토이드를 갖는 것은 다중 블라스토이드의 응집체의 형성으로 이어질 수 있다. 다음날 현미경으로 블라스토이드를 육안으로 검사하십시오. 블라스토이드가 부착되어 있는 경우, 5% 기저막 매트릭스로 보충된 사전 평형화된 CMRL 매질-1 100μL를 첨가한다. 플레이트를 인큐베이터에 놓고 하룻밤 동안 37°C에서 인큐베이션한다. 다음날 현미경으로 블라스토이드를 모니터링하십시오. 배지(100μL)의 절반을 제거하고 5% 기저막 매트릭스로 보충된 100μL의 사전 평형화된 CMRL 매질-2로 교체한다. 다음 날에는 배지(100μL)의 절반을 5% 기저막 매트릭스로 보충된 사전 평형화된 CMRL 매질-3로 교체한다. 플레이트를 인큐베이터에 놓고 하룻밤 동안 37°C에서 인큐베이션한다. 시험관 내 배양의 최대 4-6 일 동안 매일 반복하십시오.참고: 우리는 시험관내 배양된 인간 배아의 13일째의 시간 등가물에 해당하는 연장된 배양 조건에서 최대 6일 동안 블라스토이드를 배양하였다. 7. 면역염색 블라스토이드 매체를 흡인하십시오. 샘플을 5분 동안 PBS로 3x 세척한다. PBS에 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA) 200μL를 첨가하고 실온에서 30분 동안 샘플을 고정시킨다. PFA 용액을 제거하고 샘플을 10분 동안 PBS로 3x 세척하였다.참고: 블라스토이드를 마이크로웰 칩에서 배양한 경우, 다음 단계를 위해 칩에서 96웰 U-바닥 플레이트로 블라스토이드를 옮깁니다. 60분 동안 웰 당 100 μL의 블로킹 용액 (0.3% Triton-X 100 및 10% 정상 당나귀 혈청을 함유하는 PBS)에서 블라스토이드를 투과시키고 차단한다.참고: 항체의 숙주 종에 따라, 그에 따라 혈청을 적응시킨다. 차단 솔루션을 제거합니다. 신선한 블로킹 용액에 희석된 100μL 일차 항체를 첨가하고 샘플을 4°C에서 하룻밤 동안 배양한다.참고: 일차 항체의 농도는 제조업체의 지침에 따라 결정되어야 합니다. 샘플을 3x PBS(세척 용액) 중 0.1% 트리톤-X 100으로 10분 동안 세척한다. 블로킹 용액에 100 μL의 이차 항체를 20 μg/mL Hoechst 핵 염색과 함께 첨가하고 샘플을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 빛으로부터 샘플을 보호하십시오.참고: 이차 항체의 농도는 제조업체의 지침에 따라 결정되어야 합니다. 샘플을 10 분 동안 세척액으로 3x 세척하십시오. 이미징을 위해, 샘플을 PBS의 유리 바닥 μ-슬라이드 상으로 옮긴다.참고: 장착 매체는 이미징에 사용되는 목적에 따라 선택해야 합니다. 예를 들어, PBS 중의 80% 글리세롤은 오일 목적을 사용하는 동안 샘플을 장착하기 위해 사용할 수 있다.