성인 마우스의 급성 스트리아탈 슬라이스의 산소 소비율 측정
Summary
산소 소비율 (OCR)은 미토콘드리아 기능에 대한 일반적인 프록시이며 다른 질병 모델을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 Seahorse XF 분석기를 사용하여 다른 방법보다 생리 학적으로 관련성이 높은 성인 마우스의 급성 줄무늬 조각에서 OCR을 직접 측정하는 새로운 방법을 개발했습니다.
Abstract
미토콘드리아는 세포 ATP 생산, 반응성 산소 종 조절 및Ca2+ 농도 조절에 중요한 역할을 합니다. 미토콘드리아 기능 장애는 파킨슨 병 (PD), 헌팅턴 병 및 알츠하이머 병을 포함한 여러 신경 퇴행성 질환의 발병기전에 연루되어 있습니다. 이러한 질병의 모델에서 미토콘드리아의 역할을 연구하기 위해, 우리는 미토콘드리아 기능의 대리자로서 산소 소모율 (OCR)을 통해 미토콘드리아 호흡을 측정 할 수 있습니다. OCR은 이미 세포 배양물뿐만 아니라 단리된 미토콘드리아에서도 성공적으로 측정되었다. 그러나 이러한 기술은 급성 뇌 조각에서 OCR을 측정하는 것보다 생리 학적으로 관련성이 적습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 저자들은 Seahorse XF 분석기를 사용하여 성인 마우스의 급성 줄무늬 조각에서 OCR을 직접 측정하는 새로운 방법을 개발했습니다. 이 기술은 PD 및 헌팅턴 병과 관련된 뇌 영역 인 선조체에 중점을두고 최적화되어 있습니다. 분석기는 24웰 플레이트를 사용하여 살아있는 세포 분석을 수행하며, 이를 통해 24개의 샘플에 대한 동시 동역학적 측정이 가능합니다. 이 방법은 원형 펀치 조각의 삼중항 뇌 조각을 샘플로 사용합니다. 우리는 PD의 마우스 모델의 줄무늬 슬라이스에서 더 낮은 기저 OCR을 확인함으로써이 기술의 효과를 입증합니다. 이 방법은 PD 및 헌팅턴 병 분야에서 일하는 연구자들에게 광범위한 관심사가 될 것입니다.
Introduction
미토콘드리아 기능 장애는 파킨슨 병 (PD), 헌팅턴 병 및 알츠하이머 병 1,2,3을 포함한 여러 신경 질환에 연루되어 있습니다. PINK1 녹아웃 (KO) 마우스 및 래트와 같은 PD 모델은 손상된 미토콘드리아 기능 4,5,6,7,8,9,10,11을 나타낸다. 노화된 PINK1 KO 마우스의 선조체(STR) 또는 전뇌로부터 분리된 미토콘드리아는 복합체 I 7,10,12,13에서 결함을 나타낸다. 산소 소모율(OCR)을 직접 측정하는 것은 OCR이 미토콘드리아(14)의 주요 기능인 ATP 생산과 결합되기 때문에 미토콘드리아 기능을 평가하는 가장 일반적인 방법 중 하나이다. 따라서 질병 모델 또는 환자 유래 샘플 / 조직에서 OCR을 측정하면 미토콘드리아 기능 장애가 어떻게 질병으로 이어지는지 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.
현재, 클라크 전극 및 다른 O2 전극,O2 형광 염료, 및 세포외 플럭스 분석기 15,16,17,18,19를 포함하는 미토콘드리아 OCR을 측정하는 몇 가지 방법이 있다. 이점으로서,O2 전극-기반 방법은 다양한 기판이 용이하게 첨가될 수 있게 한다. 그러나 여러 샘플을 동시에 측정하기에는 충분하지 않습니다. 전통적인O2 전극 기반 방법과 비교할 때, 세포 배양 또는 정제 된 미토콘드리아에서 OCR에 일반적으로 사용되는 도구 인 세포 외 플럭스 분석기는 향상된 처리량 15,18,20을 제공합니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 모든 방법은 단리된 미토콘드리아 또는 세포 배양물6,16,17,19,20,21에서 OCR을 측정하기 위해 일반적으로 적용된다. 미토콘드리아의 분리는 의도하지 않은 손상을 일으키고, 추출된 미토콘드리아 또는 세포 배양물은 온전한 뇌 조각(22)보다 생리학적으로 덜 관련된다. 미세전극이 슬라이스에 사용되는 경우에도, 이들은 배양된 세포(23)에서보다 덜 민감하고 작동하기가 더 어렵다.
이러한 도전들을 충족시키기 위해, 우리는 XF24 세포외 플럭스 분석기를 사용하는 방법을 개발했는데, 이는 마우스(24)의 급성 삼중항 뇌 조각으로부터의 다중 대사 파라미터의 분석을 가능하게 한다. 이 기술은 OCR을 통해 미토콘드리아 호흡의 지속적인 직접 정량화를 제공합니다. 간단히 말해서, 삼중 뇌 조각의 작은 부분은 췌도 판의 우물에 배치되며, 분석기는 산소 및 양성자 형광 기반 바이오 센서를 사용하여 OCR 및 세포 외 산성화 속도를 각각17,21,25로 측정합니다.
분석기의 독특한 특징 중 하나는 최대 네 개의 화합물 또는 시약을 순차적으로 주입하면서 OCR을 계속 측정 할 수있는 네 개의 주입 웰입니다. 이것은 기저 미토콘드리아 OCR, ATP 연결 OCR 및 최대 미토콘드리아 OCR과 같은 여러 세포 호흡 파라미터의 측정을 가능하게 한다. 여기에 제시된 프로토콜에 대한 측정 동안 주입된 화합물은 첫 번째 용액 웰(포트 A)에서 10 mM 피루베이트, 두 번째 용액 웰(포트 B)에서 20 μM 올리고마이신, 세 번째 웰(포트 C)에서 10 μM 카보닐 시아나이드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP), 및 네 번째 웰(포트 D)에서 20 μM 안티마이신 A의 작동 농도를 작동시키고, Fried et al.25에 근거하여. 이들 농도는 작동 농도였고, 10x, 11x, 12x 및 13x의 스톡 용액은 용액 포트 A를 내지 D에 각각 주입하였다는 점에 유의해야 한다. 각 용액을 사용하는 목적은 다음과 같았다: 1) 피루베이트가 없었기 때문에, FCCP의 첨가는 이용가능한 기질의 제한에 의해 야기된 감소된 OCR 반응을 가질 것이기 때문에 필요하였다; 2) 올리고마이신은 ATP 신타제를 억제하고 ATP 연결된 호흡의 측정을 허용한다; 3) FCCP는 인산화로부터 산화를 해제하고 최대 미토콘드리아 용량의 측정을 허용한다; 4) 안티마이신 A는 전자 수송 사슬에서 콤플렉스 III을 억제하고, 따라서, 미토콘드리아에 연결되지 않은 OCR의 측정을 허용한다.
사용된 올리고마이신의 농도는 다음과 같은 이유에 기초하여 결정되었다: 1) 대부분의 세포 유형(단리된 미토콘드리아 또는 세포 배양물)에 대한 올리고마이신의 권장 투여량은 1.5 μM이다. 경험에 비추어 볼 때, 해리 된 세포 용량의 보통 3x-10x는 구배가있을 수 있고 슬라이스 내의 용액의 침투에는 시간이 걸리기 때문에 슬라이스 실험에 사용됩니다. 따라서, 농도는 5 μM 내지 25 μM의 범위이어야 한다. 2) A 20 μM 농도는 Fried et al.25에 기초하여 선택되었다. 더 높은 농도는 올리고마이신의 비특이적 독성으로 인해 시도되지 않았다. 3) Underwood et al.26의 보고서에서 저자들은 올리고마이신에 대한 적정 실험을 수행했으며 6.25, 12.5, 25 및 50 μg / mL의 용량이 유사한 억제를 초래한다는 것을 발견했습니다. 올리고마이신 농도가 높을수록 (50 μg/mL) 더 많이 억제되지는 않았지만 더 큰 차이가 있었다. 4) 우리의 관찰에서, 결정 인자는 올리고마이신의 침투 능력 인 것으로 보인다. 올리고마이신이 조직에 침투하는 것은 어렵고, 그래서 최대 반응인 고원에 도달하는 데 적어도 7 내지 8 사이클이 걸리는 이유이다. 고원에 도달하는 한, 억제는 최대로 가정된다.
줄무늬 조각에서 OCR을 측정하기 위해 세포외 플럭스 분석기를 적용하는 주요 기술적 과제는 조직 저산소증을 예방하는 것입니다. 완충액이 측정의 전체 기간 (약 4 시간) 동안 산소화되지 않았기 때문에, 저산소증은 중심 문제였다. 이것은 산소가 샘플 전체에 걸쳐 확산 될 수없는 두꺼운 조직 샘플의 경우 특히 그렇습니다. 이 문제를 극복하기 위해 슬라이스를 150 μm 두께로 절개하여 주변 산소가 뇌 조각의 중간에 침투 할 수 있도록했습니다. 또한, 4 mg / mL 소 혈청 알부민 (BSA)을 사전 산소화 된 인공 뇌척수액 (ACSF) 완충액에 첨가하여 이전에 제안 된 바와 같이 최대 OCR의 결정을 용이하게했습니다23. 우리는 세포가 살아 있는지 여부를 조사했습니다. 먼저, Hoechst 33258 (10 μM) 및 요오드화 프로피듐 (10 μM)을 사용하여 세포가 이러한 조건에서 건강한지 여부를 조사했습니다. 그런 다음 중간 스파이니 뉴런이 패치 클램프 기록을 사용하여 기능적으로 건강한지 여부를 조사했습니다. 우리는 또한 삼중 절편에서 도파민 (DA) 말단이 빠른 스캔 전압전류법을 사용하여 DA 방출을 측정함으로써 기능적으로 건강한지 여부를 평가했습니다. 결과는 산소화되지 않은 줄무늬 조각 (ACSF / BSA 그룹)이 산소화 된 대조군24만큼 건강하다는 것을 보여주었습니다.
그런 다음 슬라이스 두께와 펀치 크기의 다양한 조합을 테스트하여 플럭스 호흡 분석을위한 최적의 스트리아 슬라이스 조건을 결정했습니다. 두께(150 μm 및 200 μm) 및 펀치 크기(직경 1.0 mm, 1.5 mm 및 2.0 mm)가 상이한 Dorsal striatal 슬라이스를 분석기를 사용한 OCR 분석에 사용하였다. 직경 1.5mm의 펀치 크기로 두께가 150μm인 스트리아탈 슬라이스는 분석기(24)에 대해 최적의 범위 내에서 가장 높은 결합 효율 및 OCR을 가졌다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리가 개발 한 방법을 사용하면 XF 분석기를 사용하여 4 시간의 시간 동안 성인 마우스의 줄무늬 조각에서 OCR을 측정 할 수있었습니다. 이 방법은 해부학적으로 정의 된 뇌 구조에서 절제 된 펀치에서 세포 생물 에너지를 측정하는 새로운 방법을 제공합니다. 분석되는 조직 샘플이 다소 작기 때문에 질병에 관련된 특정 뇌 영역의 대사 매개 변수를 조사 할 수 있습니다. 또한, 급성 슬라이스를 사?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Wangchen Tsering과 Pamela Walter가이 원고를 비판적으로 읽고 편집 한 것에 대해 감사드립니다. 이 연구는 National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773에서 C.J. L., NS098393에서 H.Z.까지)와 Thomas Jefferson University의 신경 과학과 (Startup Funds to H.Z.)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
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